Диссертация (Имидазолиевые ионные жидкости в качестве экстрагентов, модификаторов кварцевого капилляра и хиральных селекторов в капиллярном электрофорезе), страница 7

Степени извлечениясоставили 90-113 %.Рис. 20. Схема извлечения в процессе гомогенной бессолевойэкстракции с последующей ИЖ/ИЖ микроэкстракцией [170].Применению ИЖ в экстракционных процессах посвящены обзоры [171175].Несмотря на широкое применение имидазолиевых ионных жидкостей вметодах разделения, их роль в анализе биологических сред при опрелениибиологически активных соединений изучена крайне недостаточно.Перспективным направлением является применение ИЖ в составеэлектрофоретических систем при определении диагностических маркеровзаболеваний нервной и эндокринной систем: биогенных аминов, аминокислот и50стероидных гомонов. Введение в фоновый электролит ИЖ с большимиалкильными радикалами в концентрации, выше критической концентрациимицеллообразования, может обеспечить формирование псевдостационарнойфазы, способствуя селективному разделению стероидных гормонов в режимеМЭКХ. Ковалентные покрытия на основе ИЖ в сочетании с методами on-lineконцентрированиямогутобеспечитьснижениепределовобнаруженияаналитов до значений, достаточных для анализа биологических жидкостей.Использование ИЖ в процессах экстракции может облегчить процедурупробоподготовки и сократить время анализа при определении соединенийразличной полярности.Все эти вопросы и предполагалось изучить в данной работе.51ГЛАВА II.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬII.1. Оборудование и реактивыОборудованиеРабота выполнялась на системах капиллярного электрофореза «Капель105М» со спектрофотометрическим детектором и «Capillary Electrophoresis7100» с диодной матрицей (Рис. 21). Кварцевый капилляр 50/60 см, внутреннийдиаметр 50 мкм. Кварцевый капилляр 56/64,5 см, внутренний диаметр 50 мкм.Серия экспериментов по оценке степеней извлечения аналитов из воднойфазы проводилась на жидкостном хроматографе «1200 Series» фирмы «AgilentTechnologies» с диодной матрицей, колонка «Eclips Plus C18» фирмы «Agilent»4,6*100 мм, 3,5 мкм с соответствующей предколонкой, и на жидкостномхроматографе «LC-30 Nexera» фирмы «Shimadzu», колонка Luna C18 (2)»(3.0*150 мм, 3 мкм) с соответствующей предколонкой (Рис. 22).баРис.

21. Системы капиллярного электрофореза: (а) «Капель-105М»(«Люмэкс», Россия), (б) «Capillary Electrophoresis 7100» («Agilent Technologies»,США).52абРис. 22. Высокоэффективные жидкостные хроматографы: (а) «Series1200» («Agilent Technologies», США), (б) «LC-30 Nexera» («Shimadzu», Япония)ЯМР-спектрометр «Bruker Spectrospin» AM-500.Сканирующий электронный микроскоп HITACHI S3400N с боковымдетектором Эверхарта-Торнли и кремниевым четырехквадрантным детектором.РеагентыСоляная кислота (ос.ч.), гидроксид натрия (ч.д.а.), ортофосфорнаякислота (х.ч), дигидрофосфат натрия двухводный (х.ч.), ацетат натрия(«Sigma»), борная кислота («реахим», ос.ч), хлорид меди (II) двухводный (х.ч.,«Невареактив»), сульфат цинка семиводный (х.ч., «Невареактив»), карбонатнатрия (ч.д.а. «Химреактив»), ледяная уксусная кислота («Sigma-Aldrich»),оксидалюминияметилимидазолийметилимидазолийметилимидазолий(Al2O3)хлоридхлорид(>98%,(С12MImCl,(C16MImCl,«Sigma-Aldrich»).Acrosorganics),Acrosбис(трифторметил)сульфонилимид1-додецил-31-гексадецил-3-organics),1-гексил-3-(C6MImNTf2,SoluentInnouation), 1-гексил-3-метилимидазолий тетрафторборат (C6MImBF4, Abrc), 353метил-1-октилимидазолий тетрафторборат (C8MImBF4, Merck), 3-метил-1бутилимидазолий хлорид («Sigma-Aldrich») 1-бутил-3-метилимидазолий хлоридС4MImCl («Sigma-Aldrich»), 3-метил-1-октилимидазолий хлорид С8MImCl(GmbH & Co), 1-додецил-3-метилимиазолий хлорид С12MImCl (GmbH & Co),цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ, Acros organics).

Дихлорметан (>99.7 %,«J.T. Baker»), ацетон (>99.8 %, «Merck»), диметилформамид (ДМФА) (>99.9 %,«J.T. Baker»), 1-бромбутан (99%, «ReagentPlus»), имидазол (> 99%, «SigmaAldrich»), (3-глицидоксипропил)триметоксисилан («Sigma»), 1,1-дифенил-2пикрилгидразил(DPPH)(«Sigma»),этилендиаминтетраацетатдиводороддинатрия дигидрат (Na2EDTA)(«Sigma»), ацетонитрил («криохром»,сорт 0). Глицин (Gly), 3,4- дигидроксифенилаланин (DOPA), DL-тирозин (Tyr),L-тирозин (L-Tyr), DL-триптофан (Trp), L-триптофан, L-пролин (L-Pro), Lглутаминовая кислота (L-Glu) кортизол (F), кортизон (E), кортикостерон (B), 11дезоксикортизол (S), адреналин (A), норадреналин (NA), дофамин (DA),норметанефрин (NMN) фирмы «Sigma-Aldrich», (±)-пропранолол гидрохлорид(«Sigma»),(S)-(-)-пропранололгидрохлорид(«Sigma»),(±)-карведилол(«Sigma»), (S)-(-)-карведилол («Sigma»), 18-краун-6 («Sigma»), β-циклодекстрин(«Fluka»), (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрин («Sigma-Aldrich»).Анализируемые объекты: «Анаприлин» - медицинский препарат,действующее вещество - пропранолол.

«Карведилол зентива» - медицинскийпрепарат, действующее вещество – карведилол.Биологические жидкости - образцы мочи.Вспомогательная посудаМикрошприцы вместимостью 20, 200, 1000 мкл.Баня водяная с регулируемой температурой нагрева от 30 до 90 0С.54Колбы мерные 25 мл, 50 мл, 100 мл, 250 мл.Пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл и 2 мл.Стеклянные виалы с полипропиленовыми крышками объемом 1,5 мл.Полипропиленовые виалы с полипропиленовыми крышками объемом 250 мкл.Концентратор фирмы «Eppendorf», шейкер, рН-метр фирмы «Hanna», модель HI2210-2216,весылабораторныеобщегоназначенияпоГОСТ24104,специального класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г.Приготовление стандартных, рабочих и калибровочных растворовСтандартные растворы эндогенных стероидных гормонов (кортизол,кортизон,кортикостерон,11-дезоксикортизол)иβ-адреноблокаторов(карведилол и пропранолол) с концентрацией 1 мг/мл готовили растворениемточных навесок по 1 мг каждого из аналитов в 1 мл смеси ацетонитрил:вода(1:3, объемн.) во фторопластовых пробирках.Стандартныедофамин,растворынорметанефрин)катехоламиновиаминокислот(адреналин,(триптофан,норадреналин,тирозин,3,4-дигидроксифенилаланин, глицин) готовили растворением точных навесок 1 мгкаждого из аналитов в 1 мл 0.1 М раствора HCl.

Концентрация аминокислот икатехоламинов составляла 1 мг/мл.Рабочие и калибровочные растворы готовили разбавлением стандартныхвнеобходимоеколичествораздистиллированнойводойспомощьюмикрошприца и автоматического дозатора.Полученные стандартные растворы хранили в морозильной камере при–20˚С, а рабочие и калибровочные – в холодильнике при +4–6˚С.55II.2. Синтез хиральных аминокислотных ионных жидкостейII.2.1. Синтез аминокислотных ионных жидкостей ([C2MIm][L-Pro],[C4MIm][L-Pro], [C8MIm][L-Pro], [C12MIm][L-Pro])Синтез аминокислотных ионных жидкостей выполнен согласно [176].Первоначально с помощью анионообменной смолы Amberlite IR-400 Cl изхлорида1-алкил-3-метилимидазолия(C2MImCl,C4MImCl,C8MImClиC12MImCl) получили гидроксид 1-алкил-3-метилимидазолия CnMImOH (n = 2, 4,8, 12). При перемешивании водный раствор [CnMIm]ОН добавляли по каплям кводному раствору L-пролина при 0°C.

Затем смесь нагревали до 40°С и осушалиметодом непрерывной газовой экстракции [177]. Избыток аминокислотыотделяли от продукта с помощью ацетонитрила. В результате была полученааминокислотная ионная жидкость с содержанием воды 3-4%, которуюполностью осушали под вакуумом. Полученные соединения охарактеризованыЯМР- спектрами на ядрах 1Н и 13С (Приложение 1-4)II.2.2. Синтез аминокислотной ионной жидкости [C4MIm][L-Glu]Синтез аминокислотной ионной жидкости [C4MIm][L-Glu] выполненсогласно [178]. Первоначально с помощью анионообменной смолы AmberliteIR-400 Cl из хлорида 1-бутил-3-метилимидазолия (C4MImCl) получалигидроксид 1-алкил-3-метилимидазолия C4MImOH.

При перемешивании водныйраствор [C4MIm]ОН добавляли по каплям к водному раствору L-глутаминовойкислоты при 0°C. Затем смесь перемешивали при охлаждении и нагревали до96 0С. Остаточную воду выпаривали при пониженном давлении. Для удаленияизбытка L-глутаминовой кислоты добавляли смесь ацетонитрил: метанол (4:1,объемн.) и образовавшийся осадок отфильтровывали. Фильтрат выпаривали,продукт выдерживали в вакуумном эксикаторе в течение двух дней.56Полученное соединение охарактеризовано ЯМР- спектрами на ядрах 1Н и13С (Приложение 5).II.3.

Синтез ковалентных покрытий на основе ионных жидкостейII.3.1. Травление кварцевого капилляраКварцевый капилляр промывали и заполняли 2 М раствором NaOH.Заполненный капилляр герметизировали и нагревали в термостате при 90°C втечение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры капилляр промывали0,1 М раствором HCl в течение 5 мин, деионизированной водой 10 мин иацетоном 15 мин, сушили в термостате при 120 °C в течение 1 ч.II.3.2. Силанизация кварцевого капилляраПротравленный капилляр промывали раствором, дегазированным втечение 15 мин в ультразвуковой бане, содержащим 30% (объемн.) (3глицидоксипропил)триметоксисиланаи0,1%(масс.)2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) в N,N-диметилформамиде (ДМФА).

Заполненныйкапилляр герметизировали и нагревали в термостате при 120°C в течение 6 ч.Затем интенсивно промывали ДМФА в течение 10 мин.II.3.3. Функционализация силанизированного капилляраФункционализация силанизированного капилляра осуществлялась в дваэтапа. Сначала силанизированный капилляр заполняли дегазированным вультразвуковой бане (10 мин) раствором имидазола (25 мг/мл) в ДМФА,герметизировали концы и помещали на 4 ч в термостат при 90 0С, затем избытокимидазола удаляли из капилляра путем последовательной промывки ДМФА иCH2Cl2 в течение 10 мин. Далее модифицированный капилляр заполняли 157бромбутаном, герметизировали концы и помещали в термостат на 10 часов при80 0С. Избыток 1-бромбутана удаляли путем промывки капилляра хлористымметиленом в течение 10 мин.

Перед началом работы капилляр промывали втечение 10 мин ДМФА, затем 15 мин - дистиллированной водой. Контрольстепени ковалентной модификации осуществлялся путем измерения скоростиэлектроосмотического потока (Рис. 23).ЭОП807060m AU50403020100051015мин202530Рис.23.ЭлектрофореграммамаркераЭОП.Условия: система капиллярного электрофореза «Капель 105М», фоновыйэлектролит: 10 мМ раствор NaH2PO4, pH = 2.0 (доведенный до требуемогозначения рН 0.1 М раствором HCl). Напряжение -20 кВ, детектирование – 220нм. Маркер ЭОПа – 5 %-ный (объемн.) раствор ДМФА в воде.II.3.4.