Диссертация (Изучение высвобождения лекарственных веществ в биорелевантных средах), страница 14

Все хроматограммы представлены в разделе "ПРИЛОЖЕНИЯ".3.7.2. Аналитическая область методики.Приготовление растворов стандартов, результаты измерения и обработка полученных результатов проводились в соответствии с рекомендациямиUSP [113].Аналитическая область методики количественного определения урсодезоксихолиевой кислоты в биорелевантной среде FaSSIF перекрывает интервал от 10% до 110% максимальной концентрации испытуемого раствора.3.7.3. Линейность.Номинальное значение (Со) концентрации действующего вещества вусловиях проведения теста «Растворение» для урсодезоксихолиевой кислотысоставляет:C o  500  1000  0,5 мг/мл (500 мкг/мл), где500 – содержание мелоксикама в одной таблетке, мг1000 – объем среды растворения, млДля приготовления исходного стандартного раствора урсодезоксихолиевой кислоты 0,050 г (точная навеска) стандарта урсодезоксихолиевой кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, небольшом количестве метанола, тщательно перемешивают до полного растворениястандарта и доводят объем до метки FaSSIF рН 6,5.

Полученный раствор121имеет концентрацию нифедипина 0,5 мг/мл (Исходный стандартный раствор1).Для приготовления исходного стандартного раствора урсодезоксихолиевой кислоты 0,100 г (точная навеска) стандарта урсодезоксихолиевой кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, небольшом количестве метанола, тщательно перемешивают до полного растворениястандарта и доводят объем до метки FaSSIF рН 6,5.

Полученный растворимеет концентрацию нифедипина 1,0 мг/мл (Исходный стандартный раствор2).Растворы для оценки валидационных характеристик готовили в интервале концентраций 10% - 110% от номинального значения (Со), что соответствует диапазону концентраций 2 мкг/мл –22 мкг/мл в соответствии с рекомендациями USP по определению линейности при проведении тестов "Растворение" [113].Исходный стандартный раствор 1 использовался для приготовления растворов с концентрацией 100% и меньше, раствор 2 – раствора с концентрацией 110%.Таблица 55Приготовление растворов для оценки валидационных характеристикИсходный стандартный раствор 1m, мгV, млCконцентрата мг/мл501000,5Растворы для оценки валидационных характеристикКоличество исходного стандартного раствора, млРазведение,С, мкг/млмл% от изначального Со1,01050103,010150305,010250507,010350701229,0104509010,010500100Исходный стандартный раствор 2m, мгV, млCконцентрата мг/мл1001001,0Растворы для оценки валидационных характеристикКоличество исходного стандартного раствора, млРазведение,С, мкг/мл% от изначально-мл5,510го Со550110Результаты оценки линейности методики приведены в Таблице 55.

Прямая линейной зависимости в нормализованных координатах (введено\найдено)растворов урсодезоксихолиевой кислоты в среде FaSSIF для оценки валидационных характеристик приведена ниже на Рисунке 23.Таблица 56Оценка линейности методики количественного определения урсодезоксихолиевой кислоты в среде растворения FaSSIF рН 6,5Концентрацияполученногостандартногораствора,мкг/мл (введено)50Концентрация полученного стандартного раствора,% от номинального (введено)Концентрацияполученногостандартногораствора,мкг/мл (найдено)1048,60Концентрацияполученногостандартногораствора, %от номинального (найдено)9,72%15030149,0529,81%25050251,750,34%35070351,2570,25%45090452,5590,51%500100500,00100,00%550110555,55111,11%123Рисунок 23. Оценка линейности методики количественного определения урсодезоксихолиевой кислоты в нормализованных координатах «введенонайдено» (FaSSIF рН 6,5)Коэффициент корреляции линейной регрессии r=0,999.Y-intercept (значение точки пересечения с осью ординат) составляет0,003.3.7.4.

ПравильностьПравильность оценивали с применением подхода рассмотрения результатов изучения линейности валидируемой методики: если свободный член вуравнении, статистически достоверно не отличается от нуля, то использование такой методики дает результаты, свободные от систематической ошибки.3.7.5. Прецизионность.Прецизионность оценивалась по результатам не менее 3 определенийдля каждого из 3 уровней определяемых величин (нижнего, среднего и верхнего), лежащих в пределах аналитической области методики.Таблица 57Прецизионность, проба 1(inter-day)124Кодпробывведено(мкг/мл)найдено(мкг/мл)найдено (мкг/мл),среднее значение(n=3)S.D.RSD,%ε, %48,260,070,15-3,48351,240,440,120,35554,201,270,230,7648,231-10%5048,2048,34351,671-70%1-110%350550350,80351,24554,34555,40552,87Таблица 58Прецезионность, проба 2 (intra-day)Кодпробывведено найдено(мкг/мл) (мкг/мл)найдено (мкг/мл),среднее значение(n=6)S.D.RSD, %ε, %48,620,420,87-2,76351,250,590,170,36555,571,750,311,0149,242-10%5048,8048,90350,812-70%350352,23350,78557,702-110%550556,50556,59Результаты определения правильности и прецизионности соответствовали нормам [2,113], поскольку для всех уровней концентраций величиныотносительного стандартного отклонения (RSD, %) не превышали 2% и относительной погрешности (ε, %) не превышали 5 %3.7.6.

Робастность.Для проверки робастности методики определяли стабильность стандартного раствора урсодезоксихолиевой кислоты, приготовленного для количе-125ственного определения урсодезоксихолиевой кислоты, а так же влияние изменения рН мобильной фазе на пригодность хроматографической системыХроматографировали свежеприготовленные растворы и после храненияв стеклянной колбе, в защищенном от света месте в течение 24 часов притемпературе не выше 25°С.Стабильность растворов оценивали путем сравнения площадей пиковурсодезоксихолиевой кислоты после хроматографирования свежеприготовленных растворов и растворов после хранения. Площадь пика урсодезоксихолиевой кислоты в свежеприготовленном растворе принимали за 100 %.Определяли относительное отклонение площади пика (в %) урсодезоксихолиевой кислоты от площади, принятой за 100 %.Если отличие Zi от 100 % не превышает 5 %, то раствор считается стабильным в течение испытуемого срока, при невыполнении условия срокихранения растворов сокращаются до срока, в течение которого стабильностьсохраняется.Результаты представлены в таблице 58.Таблица 59Стабильность стандартного раствора УДХККонцентра- Срокция раствохрара, мг/млнения,(введено, Xi) суток0500123КонцентрацияанализируеZi,%|Zi мого раство- (Zi=Yi/X100%|Среднеера, мг/млi*100%)значение (найдено, Yi)Площадь пикаУДХКn=3830991831624833046829527829046829394828106828371828772827493831887,00500,000100,00%0,00%829322,33498,45999,69%0,31%828416,33497,91499,58%0,42%827416,6497,31399,46%0,54%1267827157827600825495825715,65825741496,29199,26% 0,74%7825911820462820984,67821435493,44798,69% 1,31%7821057Для оценки влияния рН буферного компонента мобильной фазы готовили 0,075 M раствор KH2PO4, со значениями рН 2,95; 3,00 и 3,05.

Стандартныйраствор урсодезоксихолиевой кислоты хроматографировали в трех ПФ, оценивая пригодность хроматографической системы.Хроматографическая система считалась пригодной, если: эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику нифедипина - не менее 2000 теоретических тарелок; фактор асимметрии площади пика нифедипина - не менее - 0,8 ине более 1,5; относительное стандартное отклонение площади пика нифедипина- не более 2 % .Результаты средних значений представлены в таблице 59.Таблица 60Влияние состава ПФ на пригодность хроматографической системыКритериигодностипри-рН 0,075 M раствора KH2PO42,953,003,05102181019310189As1,11,081,09RSD, %0,380,350,36ЧТТ3.7.7.

Валидационные характеристики1. На хроматограммах биорелевантной среды FaSSIF и модельнойсмеси-плацебо отсутствуют пики, по времени удерживания сов-127падающие с действующим веществом, что является подтверждением специфичности разработанной методики.2. Полученные значения детектируемых действующих веществ соответствовали нормам, что, в свою очередь, подтверждает правильность валидируемой методики.3. Линейность разработанной методики в диапазоне содержаниядействующего вещества в диапазоне 10% - 110% от заявленногосодержания подтверждена путем анализа модельных смесей свышеуказанным содержанием действующего вещества и последующим построением калибровочной кривой.

Величина коэффициента корреляции r = 0,999.4. При оценке повторяемости величина относительного стандартного отклонения составила менее 2%.5. По результатам проведенных валидационных испытаний можносделать вывод о том, что разработанная методика определенияурсодезоксихолиевой кислоты в биорелевантной среде FaSSIFметодом ВЭЖХ является пригодной.128ГЛАВА 4. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.1.На основании имеющихся в литературе данных об использованиибиорелевантных сред для проведения испытаний по оценке высвобождениядействующего вещества из твердой дозированной лекарственной формыосуществлён научно-обоснованный выбор объектов исследования, относящихся ко 2 классу БКС и характеризующихся как малорастворимые и практически нерастворимые соединения: слабых кислот (мелоксикам), слабыхоснований (нифедипин) и практически нерастворимых веществ (урсодезоксихолиевая кислота).2.Разработаны унифицированные методики количественного опре-деления нифедипина, мелоксикама, урсодезоксихолиевой кислоты в фармакопейных и биорелевантных средах растворения: нифедипин – ВЭЖХ-УФ238 нм, мелоксикам – ВЭЖХ-УФ 362 нм, урсодезоксихолиевая кислота –ВЭЖХ-УФ 214 нм.3.Проведена валидация разработанных методик количественногоопределения нифедипина, мелоксикама, урсодезоксихолиевой кислоты вфармакопейных и биорелевантных средах растворения по критериям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность.

Данные, полученные врезультате всех валидационных испытаний, отвечают заданным критериямприемлемости. Аналитический диапазон концентраций для препаратов нифедипина составляет 10% - 110% от заявленного содержания, для препаратовмелоксикама 20% - 110% и для препаратов урсодезоксихолиевой кислоты10% - 110% от заявленного содержания. Показана пригодность разработанных методик для количественного определения действующих веществ припроведении сравнительного теста кинетики растворения в биорелевантныхсредах для твердых дозированных лекарственных форм.4.В результате изучения высвобождения действующих веществ извыбранных объектов исследования в фармакопейных и биорелевантных средах растворения установлено, что для препаратов нифедипина фармакопей-129ные среды растворения не обладают достаточной дискриминирующей способностью при проведении исследования кинетики растворения, поэтому целесообразно использовать биорелевантные среды.