Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 9

Параметры пригодности хроматографической системыПараметры, дающие возможность оценить приемлемость выбранныхусловий хроматографирования для достижения объективности получаемыхрезультатов, представлены в таблице 11. Полученные данные свидетельствуют осоответствиипоказателейхроматографическойсистемыпредъявляемымтребованиям.ПараметрНорма [10]ФактическоезначениеЭффективность (числотеоретических тарелок)Не менее 300025123Разрешающая способностьНе менее 1,5Больше 1,5Коэффициент асимметрии пикаПинолинНе более 2,01,376-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-βНе более 2,01,24карболинаОтносительное стандартноеотклонениеПинолинне более 2,0%0,96%6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-βне более 2,0%1,04%карболинаТаблица 11 - Основные характеристики пригодности хроматографическойсистемы.563.2.1.1. СелективностьСелективность методики оценивали на плазме и на моче без добавлениястандартных образцов и с их добавлением.На хроматограммах образцов интактной плазмы, очищенной от пинолина иего метаболита путем жидкостной экстракции, отобранных у 6 лиц, ненаблюдалось пиков с временами удерживания, соответствующими пинолину,метаболиту пинолина и галантамину.На хроматограмме плазмы, содержащей стандартные образцы пинолина, егометаболита и галантамина (рис.

9), времена удерживания не накладывались.Разрешение пиков составляло более 1,5 между каждым пиком.Приготовление интактной плазмы. К 1000 мкл плазмы прибавляли 400 мклборатного буфера рН 9,6 и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали в течение 10минут, для полноты экстракции, затем центрифугировали на центрифуге вортексв течение 10 минут при скорости 13000 об/мин. В качестве интактной плазмыотбирали нижний слой.На хроматограммах образцов интактной плазмы, очищенной от пинолина иего метаболита путем жидкостной экстракции, отобранной у 6 лиц, ненаблюдалось пиков с временами удерживания, соответствующими пинолину,метаболиту пинолина и галантамину.На хроматограмме плазмы, содержащей стандартные образцы пинолина, егометаболита и галантамина, времена удерживания не накладывались.

Разрешениепиков составляло более 1,5 между каждым пиком.Приготовление интактной мочи. К 1000 мкл мочи прибавляли 400 мклборатного буфера рН 9,6 и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали в течение 10минут, для полноты экстракции, затем центрифугировали на центрифуге вортексв течение 10 минут при скорости 13000 об/мин. В качестве интактной мочиотбирали нижний слой.По данным результатов было сделано заключение, что методика являетсяселективной.57Рисунок 9 - Хроматограмма интактной плазмы, содержащего стандартныеобразцы пинолина, 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина и галантамина3.2.1.2. Линейность зависимости отклика от концентраций определяемыхвеществЛинейность – способность методики в диапазоне применения даватьвеличинысигнала,прямопропорциональныесодержаниюопределяемогокомпонента.С целью оценки линейности методики осуществлялось построениекалибровочного графика.

Для построения калибровочного графика готовиликалибровочныемодельныесмесипутёмвнесениявинтактнуюплазму58(приготовление см. раздел 3.2.1.1) крови и в мочу пинолина, его метаболита игалантамина. Также готовили калибровочные модельные смеси в интактной моче.3.2.1.2.1. Получение данных для построения калибровочного графикаДля получения данных, используемых при построении калибровочногографика, калибровочные образцы подвергали процедурам пробоподготовки.Такжеанализировалибланковыематрицы.Вдальнейшемвыполнялихроматографическое исследование полученных экстрактов.3.2.1.2.2.

Построение калибровочного графикаПостроение калибровочного графика осуществляли с помощью программыMicrosoft Excel 2010. После хроматографирования полученных растворов строиликалибровочныеграфикизависимостиотношенияплощадейисследуемоговещества к внутреннему стандарту (ось Y) от известных концентраций (ось X),по которым определяли концентрации пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроβ-карболина.

При этом определяли характер зависимости, тип аппроксимации,достоверность аппроксимации и коэффициенты соответствующего уравнениярегрессии.3.2.1.2.3. Оценка линейностиПредставленные данные свидетельствуют о том, что для определяемоговещества калибровочные графики описываются линейной функцией с высокимпоказателем достоверности аппроксимации. В плазме коэффициент корреляции(R) составил 0,99474 для пинолина и R=0,99534 для 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболина, что соответствует требованиям валидации методики (неменее 0,99 %).

В моче коэффициент корреляции (R) составил 0,9913 для пинолинаи R=0,9939 для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина, что соответствуеттребованиям валидации методики (не менее 0,99 %).59Рисунок 10 - Калибровочный график зависимости концентрации пинолина отплощади пика в плазме крови.Рисунок 11 - Калибровочный график зависимости концентрации 6-гидрокси1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина от площади пика в плазме крови.60Рисунок 12 - Калибровочный график зависимости концентрации пинолина отплощади пика в моче.Рисунок 13 - Калибровочный график зависимости концентрации 6-гидрокси1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина от площади пика в моче.Был выполнен расчёт концентраций пинолина и его метаболита поуравнению калибровочной зависимости, после чего полученные результатысравнивались с фактическими, а затем были рассчитаны значения относительнойпогрешности (табл. 12, 13, 14, 15).61C факт,пг/млПлощадьпикаС рассчит,пг/млε, %Норма0,250,3750,50,751,01,251,5196428763529557171149140107250,2710,3960,4860,7680,9801,2601,4788,27Неболее20 %5,70-2,732,37-1,960,77-1,46Не более 15%Таблица 12 - Отклонения концентраций пинолина калибровочных растворов вплазме от фактических значений.C факт,пг/млПлощадьпикаС рассчит,пг/млε, %НормаТаблица0,250,3750,50,751,01,251,51986305747586368900110475133470,2240,3940,5090,7420,9891,2401,508-10,22Неболее20 %5,121,79-1,06-1,07-0,800,5713-Не более 15%Отклоненияконцентраций6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина калибровочных растворов в плазме от фактических значений.C факт,пг/млПлощадьпикаС рассчит,пг/млε, %Норма0,250,3750,50,751,01,251,5204525873749552771488993109420,2820,3570,5170,7620,9851,2391,50812,73Неболее20 %-4,923,341,56-1,49-0,850,53Не более 15%Таблица 14 - Отклонения концентраций пинолина калибровочных растворов вмоче от фактических значений.62C факт,пг/млПлощадьпикаС рассчит,пг/млε, %НормаТаблица0,250,3750,50,751,01,251,52479274344786541920110417131950,2800,3544,790,7621,0111,2331,49112,07Неболее20 %-5,67-4,191,631,13-1,35-0,5815-Не более 15%Отклоненияконцентраций6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина калибровочных растворов в моче от фактических значений.Полученные значения относительной погрешности соответствуют требованиям(не более 20% - для нижней точки, не более 15% - для остальных).3.2.1.3.

Оценка правильности и прецизионности методикиПравильность – величина, отражающая степень соответствия междуистинным значением измеряемой концентрации и результатом, полученным поданнойметодике.Показателиправильностиоценивалисьпоуровнюотносительной погрешности получаемых результатов (выраженное в процентахотношение разности «полученное значение – истинное значение» к истинномузначению концентрации, метод «введено – найдено»).Прецизионность – величина, выражающая степень близости (или разброса)результатов для серии измерений, выполненных по данной методике наразличных пробах одного и того же однородного образца.

Показателипрецизионностиоценивалисьпоуровнюотносительногостандартногоотклонения.Оценку показателей правильности и прецизионности осуществляли путёмисследования образцов контроля качества на 4 уровнях концентраций: 250 пг/мл,375 пг/мл, 750 пг/мл и 1500 пг/мл. Правильность и прецизионность определяли втечение 1 рабочего дня (внутри серии) и в течение нескольких дней (междусериями). Расчёт концентраций определяемых веществ в образцах контроля63качества выполняли по уравнению калибровочного графика, полученного всоставе текущей аналитической серии.

Результаты представлены в таблице 16, 17.Введено Относительное(пг/мл)стандартное Относительная погрешность, %отклонение, %Внутри серии МеждуВнутрисерии Между(n=5)сериями (n=10)(n=5)сериями (n=10)2508,959,0111,2412,483757,137,477,658,127504,674,815,125,8715001,571,143,123,31Таблица 16 - Правильность и прецизионность методики количественногоопределения пинолина.Введено Относительное(пг/мл)стандартное Относительная погрешность, %отклонение, %(n=5)Внутри серии Между сериями Внутри серии Между(n=5)(n=10)(n=5)сериями (n=10)2506,847,359,1211,643755,786,018,059,187504,124,415,616,1215002,852,904,124,48Таблица 17 - Правильность и прецизионность методики количественногоопределения 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина.Правильность и прецизионность методики соответствуют требованиям (неболее 20% - для нижней точки, не более 15% - для остальных).3.2.1.4.