Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 8

Дизайн фармакологической частиВ исследовании принимали участие 20 мужчин (средний возраст —39,5 ± 9,5 года), страдающих алкогольной зависимостью и находящихся настационарном лечении в ГБУЗ «МНПЦ наркологии ДЗМ». В период актуализациипатологического влечения пациенты получали галоперидол в таблетированнойформе (ООО «Озон», Россия) в дозировке 5,00 ± 1,87 мг/сут (9 пациентов,однократный прием) и в инъекционной форме (ЗАО «БРЫНЦАЛОВ-А», Россия) в45дозировке 5,86 ± 2,39 мг/сут (11 пациентов, однократный прием).

Критериивключения в исследование: терапия, содержащая галоперидол длительностью 5дней; пероральная и внутримышечная формы введения галоперидола; отсутствиев анамнезе сопутствующего психического заболевания. Критерии исключения:применение в терапии иных антипсихотических препаратов, помимо галоперидола; клиренс креатинина < 50 мл/мин, концентрация креатинина в плазмекрови ≥ 1,5 мг/дл (133 мкмоль/л); масса тела менее 60 кг или превышающая100 кг; возраст 75 лет и более; наличие противопоказаний к применениюгалоперидола..46ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1.

Разработка методики количественного определения пинолина и 6гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина3.1.1. Выбор внутреннего стандартаДля выбора внутреннего стандарта обычно руководствуются следующимипринципами:Внутреннийстандартдолженхорошосмешиватьсявтехрастворителях, из которых состоит анализируемая проба, также стандартноевещество должно быть инертно по отношению к компонентам пробы иподвижной фазе.Пик внутреннего стандарта на хроматограмме должен располагатьсярядом с исследуемыми веществами, но при этом не должен накладыватьсяна них.Стандартный образец внутреннего стандарта не должен содержатьпримеси, которые могут накладываться на анализируемые пики.Внутреннийстандартподбиралисучетомструктурнойформулы,молекулярной массы и значением рКа.

Молекулярная масса и значение рКа дляпинолина составляют 203 г/моль и 9,04, LogP = 1,25. В качестве внутреннегостандарта был подобран галантамин с молекулярной массой 288 г/моль изначение рКа 8,94, LogP = 1,75, структурная формула представлена на рисунке 7.При дальнейшем исследовании было установлено, что галантамин по всемтребованиям подходит в качестве внутреннего стандарта при определениипинолина и его метаболита [5].47Рисунок 7 - Внутренний стандарт галантамин.3.1.2.

Пробоподготовка3.1.2.1. Отбор проб. ПробоподготовкаОтбор проб проводится таким образом, чтобы гарантировать отсутствиеизменений в составе образца, как с качественной, так и с количественнойстороны.Вот несколько общих правил, которым необходимо следовать дляправильного отбора проб:1.отбор проб должен производиться обученным и квалифицированнымилюдьми;2.отбор каждой пробы должен происходить отдельно;3.приборыдляотборапробдолжныгарантировать отсутствиезагрязнения;4.отобранные пробы должны храниться соответствующим образом.В качестве проб берут биообъекты — кровь и мочу. Перед экстракциейкровь центрифугируют, и для дальнейшего анализа отбирают плазму.Правильная подготовка пробы является одним из самых главных моментовпри проведении анализа.

Как правило, пробоподготовка состоит из несколькихэтапов: экстракция вещества из пробы и химическая обработка (дериватизация),позволяющая перевести исследуемое вещество в форму, более подходящую дляанализа.483.1.2.2. Пробоподготовка плазмы кровиДля экстракции пинолина и его метаболита были проведены нескольковариантов пробоподготовки плазмы. Пробоподготовку проводили на серияхподготовленных проб с известным содержанием исследуемых веществ ивнутреннего стандарта.Приготовление интактной плазмы.

К 1000 мкл плазмы прибавляли 400 мклборатного буфера рН 9,6 и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали в течение 10минут, для полноты экстракции, затем центрифугировали на центрифуге вортексв течение 10 минут при скорости 13000 об/мин. В качестве интактной плазмыотбирали нижний слой.Пробоподготовка 1.К 400 мкл пробы (интактной плазмы) (табл. 5) прибавляли 1200 мклацетонитрила для осаждения белков. Смесь встряхивали в течение 10 минут, дляполноты экстракции, затем центрифугировали на центрифуге вортекс в течение10 минут при скорости 13000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость ипроводили выпаривание до сухого остатка.

Сухой остаток растворяли в 100 мкл 1% растворе муравьиной кислоты в воде.№ пробыПинолинМетаболитГалантаминОбъем пробы(интактнаяплазма)1.1100 пг/мл100 пг/мл20 нг/мл400 мкл1.2500 пг/мл500 пг/мл20 нг/мл400 мкл1.31000 пг/мл1000 пг/мл20 нг/мл400 мкл1.4529 нг/мл538 нг/мл492 нг/мл400 мкл1.5 (плазма)000400 мклТаблица 5 - Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки 1.Пробоподготовка 2.К 400 мкл пробы (интактной плазмы) (табл. 6) прибавляли 400 мклацетонитрила для осаждения белков.

Также ацетонитрил является экстрагентом.Смесь встряхивали в течение 10 минут, для полноты экстракции, затем49центрифугировали на центрифуге вортекс в течение 10 минут при скорости 13000об/мин. Отбирали надосадочную жидкость на анализ.№ пробыПинолинМетаболитГалантаминОбъем пробы(интактнаяплазма)2.1100 пг/мл100 пг/мл20 нг/мл400 мкл2.2500 пг/мл500 пг/мл20 нг/мл400 мкл2.31000 пг/мл1000 пг/мл20 нг/мл400 мкл2.4529 нг/мл538 нг/мл492 нг/мл400 мкл2.5 (плазма)000400 мклТаблица 6 - Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки 2.Пробоподготовка 3.К 400 мкл пробы (интактной плазмы) (табл. 7) прибавляли 200 мклборатного буфера рН 9,6 и 1000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали в течение 10минут, для полноты экстракции, затем центрифугировали на центрифуге вортексв течение 10 минут при скорости 13000 об/мин.

Отбирали надосадочнуюжидкость и проводили выпаривание до сухого остатка. Сухой остаток растворялив 100 мкл 1 % растворе муравьиной кислоты в воде.№ пробыПинолинМетаболитГалантаминОбъем пробы(интактнаяплазма)3.1100 пг/мл100 пг/мл20 нг/мл400 мкл3.2500 пг/мл500 пг/мл20 нг/мл400 мкл3.31000 пг/мл1000 пг/мл20 нг/мл400 мкл3.4529 нг/мл538 нг/мл492 нг/мл400 мкл3.5000400 мклТаблица 7 - Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки 3.50Пробоподготовка 4.Перед внесением пробы (интпктная плазма) (табл. 8.) в картридж С18 дляТФЭ проводили активацию сорбента. В картридж, подключенный к вакуумномунасосу, вносили 2 мл метанола, затем 1 мл воды и 2 мл боратного буфера рН 9,6.В активированный картридж вносили 400 мкл пробы разбавленной 400 мклфизиологического раствора, затем последовательно добавляли 1 мл воды, 1 млсмеси ацетонитрил : вода (10 : 90), элюирование проводили 0,5 мл 0,1 %раствором триэтиламина в метаноле.

Полученный элюат выпаривали до сухогоостатка и растворяли 100 мкл 1 % муравьиной к-ты в воде.№ пробыПинолинМетаболитГалантаминОбъем пробы(интактнаяплазма)4.1100 пг/мл100 пг/мл20 нг/мл400 мкл4.2500 пг/мл500 пг/мл20 нг/мл400 мкл4.31000 пг/мл1000 пг/мл20 нгмл400 мкл4.4529 нг/мл538 нг/мл492 нг/мл400 мкл4.5000400 мклТаблица 8.

Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки 4.3.1.2.3. Пробоподготовка мочиОбразцы чистой и исследуемой мочи хранили в морозильнике для плазмыпри температуре от – 75 оС до – 80 оС. Стандартные растворы хранили вхолодильнике при температуре 2 – 8 оС. Приготовление интактной мочи. К 1000мкл мочи прибавляли 400 мкл боратного буфера рН 9,6 и 2000 мкл этилацетата.Смесь встряхивали в течение 10 минут, для полноты экстракции, затемцентрифугировали на центрифуге вортекс в течение 10 минут при скорости 13000об/мин. В качестве интактной мочи отбирали нижний слой.Пробоподготовку проводили на сериях подготовленных проб с известнымсодержаниемисследуемыхвеществивнутреннегостандартаметодомтвердофазной экстракции. Перед внесением пробы (табл. 9) в картридж С18 для51ТФЭ проводили активацию сорбента. В картридж, подключенный к вакуумномунасосу, вносили 2 мл метанола, затем 1 мл воды и 2 мл боратного буфера рН 9,6.Вактивированныйкартриджвносили2000мклпробы,затемпоследовательно добавляли 1 мл воды, 1 мл смеси ацетонитрил : вода (10 : 90, об),элюирование проводили 0,5 мл 0,1 % раствором триэтиламина в метаноле.Полученный элюат выпаривали до сухого остатка и растворяли 100 мкл 1 %муравьиной к-ты в воде.№Пинолин, пг/мл Метаболит, пг/млГалантамин, нг/млпробыОбъемпробы(интактнаямоча)Т.1250250202000 мклТ.2375375202000 мклТ.3500500202000 мклТ.4750750202000 мклТ.510001000202000 мклТ.612501250202000 мклТ.715001500202000 мклТ.800202000 мклТаблица 9 - Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовкимочи.3.1.2.4.

Выводы по результатам пробопоготовкиПриразработкеметодикибылиопробованыразличныевидыпробоподкотовки. Поскольку концентрации аналитов находились в пределахнескольких сотен пикограмм, нужно было сконцентрировать пробу дляопределениянаВЭЖХнаиболеенизкойконцентрации.Изметодовпробоподготовки, описанных в разделе «3.1.2.2. Пробоподготовка плазмы крови»,наиболее чувствительной пробоподготовкой была с применением ТФЭ. Такжепроподготовка c ТФЭ применялась и для мочи.523.1.3. Хроматографические условияВ качестве метода определения был выбран метод обращеннофазнойвысокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс- детектором,как чувствительный и специфичный.Исследуемыевеществаявляютсянеполярными,ароматическимиипроявляют основные свойства. Для хроматографирования полученных пробприменяли колонку Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм спредколонкой Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм.Ниже приведены хроматографические условия разработанной методики [3,1, 4, 6, 8, 7, 2]:Хроматограф: Agilent 1290 Infinity;Предколонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм (кат.

№ 821125936);Колонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм (кат.№ 959758-902K);Температура колонки: (50 ± 1) ºС;Скорость потока: 0,4 мл/мин;Детектирование: МС/МС, MRM-переходы для пинолина 203,2 m/z → 174,0 m/z,для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина 189,2 m/z → 160,0 m/z, длягалантамина 288,3 m/z → 213,0 m/z;Метод ионизации: электроспрей (ESI) в положительной полярности;Объем пробы: 5 мкл.Ориентировочные времена удерживания в плазме крови:6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин;пинолин – около 5,0 мин;галантамин – около 2,4 мин.Ориентировочные времена удерживания в моче:6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин;пинолин – около 5,0 мин;галантамин – около 2,4 мин.53Время хроматографирования: 14 мин.Подвижная фаза:Элюент А: 5 мМ аммония формиата и 0,01 % муравьиной кислоты в воде.Элюент B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.МетодикаСтабилизируют систему ВЭЖХ в условиях начального градиента (элюент А: элюент В = 95 % : 5 %) в течение 15 мин.Градиентная программа:Время, минЭлюент А, % (об/об)Элюент В, % (об/об)09551,5955270308,540601295514955Пригодность хроматографической системы.Пригодность хроматографической системы рассчитывали по хроматограмме,полученной от масс-детектора.Эффективность колонки:эффективность колонки, рассчитанная по пику пинолина и 6-гидрокси1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина составила 25123;коэффициент разрешения между пиками пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболином был больше 1,5;фактор асимметрии пика пинолина составил 1,37;факторасимметриисоставил 1,24.пика6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина54Рисунок 8 - Образец хроматограммы: пинолин, 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболин и галантамин.3.1.4.

Масс спектр условия.Были подобраны MRM переходы для пинолина, его метаболита ивнутреннегостандартагалантаминаметодомэлектрораспылениявположительной полярности (табл. 10).Пинолин 203,2 m/zm/zНапряжение фрагментации (V)Энергия соударения (V)17465151596527143653513165356-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин 189, m/zm/zНапряжение фрагментации (V)Энергия соударения (V)16075151177530917535Галантамин 288,3 m/zm/zНапряжение фрагментации (V)Энергия соударения (V)23113019225130152131301919813035Таблица 10 - Значения напряжения фрагментации и энергии соударения для MRMпереходов.553.2. Валидация методики определения пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболинМетодика была валидирована на основе «Руководства по экспертизелекарственных средств» [18], а также руководств FDA [48] и EMA [49].Валидация методики проводится для подтверждения ее надежности дляопределенияконцентрациихарактеристиками, которымиявляютсяселективность,пинолинаиегометаболита.Основнымидолжна обладать валидированнаянижнийпределколичественногометодика,определения,линейность, прецизионность, эффекты матрицы, стабильность исследуемыхвеществ в биологической матрице в течение всего периода хранения и обработки.3.2.1.