Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 11

Зависимость активности изофермента СУР 2D6 и измененияотношения пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболинаИзофермент CYP 2D6 участвует в метаболизме по разным оценкам от 15 до25%ЛС[11,25,31].Субстратамиэтогоизоферментаявляютсясильнодействующие ЛП, которые применяются в психиатрии и при лечениисердечно-сосудистых заболеваний.

При неправильной дозировке или приизменении активности изофермента CYP 2D6 вследствии генетических факторовили внешних воздействий могут проявиться серьезные НЛР, а также можетнаблюдаться отсутствие фармакологического эффекта.Целью нашей работы является разработать методику количественногоопределения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS для оценкиактивности изофермента CYP 2D6. Для достижения этой цели были подобраныоптимальныеусловияпробоподготовкибиологическихматрицибыларазработана и валидирована методика количественного определения. Затем,методика была апробирована на пациентах для изучения активности CYP 2D6 [19,36, 37]. Также для оценки возможности использования методики для определенияизмененийактивностиприприемеингибиторовактивностиCYP2D6количественное определение проводили у пациентов при приеме ингибиторов.В исследовании принимали участие 20 мужчин (средний возраст —39,5 ± 9,5 года), страдающих алкогольной зависимостью и находящихся настационарномлечениивМНПЦнаркологии.Впериодактуализациипатологического влечения пациенты получали галоперидол в таблетированнойформе (ООО «Озон», Россия) в дозировке 5,00 ± 1,87 мг/сут (9 пациентов,однократный прием) и в инъекционной форме (ЗАО «БРЫНЦАЛОВ-А», Россия) вдозировке 5,86 ± 2,39 мг/сут (11 пациентов, однократный прием).

Критериивключения в исследование: терапия, содержащая галоперидол длительностью 5дней; пероральная и внутримышечная формы введения галоперидола; отсутствиев анамнезе сопутствующего психического заболевания. Критерии исключения:применение в терапии иных антипсихотических препаратов, помимо галоперидола; клиренс креатинина < 50 мл/мин, концентрация креа тинина в плазме73крови≥ 1,5 мг/дл (133 мкмоль/л); масса тела менее 60 кг или превышающая100 кг; возраст 75 лет и более; наличие противопоказаний к применениюгалоперидола.В качестве биообъекта собирали утреннюю мочу пациентов, находящихсяна лечении препаратом.

Забор материала проводили в количестве не менее 10 млв сухой стерильный флакон. Первый отбор образцов проводился до началалечения, а затем через 5 дней, после начала приема препарата.Время от момента забора клинического материала до его доставки влабораторию составляло: при комнатной температуре (18–25 °C) — не более 6часов; при температуре 2–80 °C — не более 1 суток (при доставке в лабораториюв специальных термоконтейнерах с хладогеном, термосах с термопакетами).Образцы исследуемой мочи хранили в морозильникедля плазмы притемпературе от – 75 оС до – 80 оС.Метод пробопоготовки отобранной мочи, описан в разделе «3.1.2.3.Пробоподготовка мочи».3.3.1.

Изучение влияния почечной патологии на активность изоферментаCYP 2D6В исследовании приняли участие те же пациенты, так как у них в анамнезе увсех значился алкогольный гепатит. В контрольной группе исследовались 20добровольцев мужского пола в возрасте от 30 до 48 лет с верифецированнымдиагназом «здоров», не приниавших никакого лечения (табл. 34).№пациентаИспытуемая группа до начала лечения Контрольная группаПинолин Метаболит Метаболическое Пинолин Метаболит Метаболическое(пг/мл)(пг/мл)отношение(пг/мл)(пг/мл)отношение149014933,04339348814262,917906214876420,4317734239832,320793102111111,0881499799630,983573411667430,63722167914992,206862530913414,339806118312411,04931614782520,1704647005390,7708674788515781,78305161312762,081413812088650,716065809051,55985297518411,1198435410142,860647105042780,5515876638821,3294821185310141,188746102511341,1065691214932640,17675391113281,457815133987401,85929676412321,61131814101114271,411474104913881,323091514958320,5565224099952,429642163674801,30790216006290,393621714882780,1868183049102,9888761814458250,5709348609651,121661925614075,49609453711082,063862014632670,1824834349782,2511619788341,34091872810701,74141510168290,90210567110051,5847,2753,75106,4444,7123,4343,24Ср.значениеМедианаКоэффициентвариацииТаблица 34 - Расчитанные значения концентраций пинолина и его метаболита,метаболический индекс.Статистический анализ результатов исследования производили методаминепараметрической статистики с помощью пакета прикладных программ StatsoftStatistica v.

10.0.При выбореметодабраливовниманиенормальностьраспределения выборок, которую оценивали с помощью W-теста Шапиро–Уилка.Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 (при статистическоймощности свыше 80 %). Для определения корреляционной связи междуколичественнымихарактеристикамивычисляликоэффициентранговойкорреляции Спирмена (rS). Значение коэффициента корреляции rS в диапазоне от0,3 до 0,7 при р < 0,05 означало положительную умеренную, но достоверную75корреляцию между признаками; rS > 0,7 при р < 0,05 — сильную и достовернуюсвязь; отрицательное значение rS соответствовало обратной корреляции.Было доказано, что статистически значимого отличия между больнымиалкогольнымгепатитомиздоровымидобровольцамивотношенииметаболической активности CYP 2D6 нет (р > 0,05 ).3.3.2. Изменение активности изофермента CYP 2D6 под действиемингибиторов и индукторовТак как пациенты получали галоперидол, который является классическимингибитором CYP 2D6, то в нашем исследовании были измерены метаболическиеотношения по пинолину до начала лечения и после 2 недель приемагалоперидола.

Результаты приведены в таблице 35.№пациентаДо начала леченияПосле 2 недель приема галоперидолаПинолин Метаболит Метаболическое Пинолин Метаболит Метаболическое(пг/мл)(пг/мл)отношение(пг/мл)(пг/мл)отношение149014933,04339312282730,222649214876420,43177384914471,7029133102111111,08814911044710,426584411667430,6372217324030,550722530913414,339806137413190,960297614782520,1704649556300,660424788515781,78305110497280,693815812088650,7160614298510,59561197518411,119844603570,776271105042780,5515874386771,5448671185310141,18874648614042,8840121214932640,17675311099620,867568133987401,85929636714984,08174414101114271,411474147512110,8207031514958320,55652212955470,422461163674801,30790293612521,3370171714882780,18681810119400,929881814458250,5709343959212,328051761925614075,4960948434710,558542014632670,18248313347820,586789788341,3409189437661,1490158290,9021059838160,8053,75106,4438,6445,3683,85Ср.значениеМедиана 1016Коэффициент 47,27вариацииТаблица 35 - Расчитанные значения концентраций пинолина и его метаболита,метаболический индекс.Статистический анализ результатов исследования производили методаминепараметрической статистики с помощью пакета прикладных программ StatsoftStatistica v.

10.0.При выбореметодабраливовниманиенормальностьраспределения выборок, которую оценивали с помощью W-теста Шапиро–Уилка.Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 (при статистическоймощности свыше 80 %). Для определения корреляционной связи междуколичественнымихарактеристикамивычисляликоэффициентранговойкорреляции Спирмена (rS).

Значение коэффициента корреляции rS в диапазоне от0,3 до 0,7 при р < 0,05 означало положительную умеренную, но достовернуюкорреляцию между признаками; rS > 0,7 при р < 0,05 — сильную и достовернуюсвязь; отрицательное значение rS соответствовало обратной корреляции.Как видно из приведенных данных в процессе лечения ингибитором CYP2D6 галоперидолом метаболическое отношение снижается (rS в диапазоне от 0,3до 0,7 при р < 0,05 ). Данную методику можно использовать для оценкиактивности изофермента CYP 2D6 при приеме индукторов.77ОБЩИЕ ВЫВОДЫ1. На основании изученных научных статей и монографий обоснован выбор вкачестве объектов исследования пинолина и его метаболита 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболина и подхода к их количественному определению в плазмекрови человека и моче.

Учитывая все рассмотренные данные, был сделан выводоб актуальности данного исследования и были созданы общие подходы к анализуизучаемых веществ.2. Разработаны методики количественного определения пинолина и егометаболита 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина в плазме крови человека имоче с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии стандемнымусловиямасс-селективнымхроматографированиядетектированием.анализируемыхПодобранывеществ.Изоптимальныеразличныхопробованных методов пробоподготовки выбран метод ТФЭ, как наиболеечувствительный.3. Разработаннаяметодикавалидировананаоснове«Руководствапоэкспертизе лекарственных средств» [5], а также руководств FDA [29] и EMA [30].Валидацию проводили по следующим параметрам: селективность, нижний пределколичественногоопределения,линейность,правильность,прецизионность,эффекты матрицы, стабильность исследуемых веществ в биологической матрицев течение всего периода хранения и обработки4.

Проведена оценка активности изофермента цитохрома Р450 CYP 2D6 упациентов с алкогольным гепатитом с помощью разработанной методики. Порезультатам было доказано, что статистически значимого отличия междубольными алкогольным гепатитом и здоровыми добровольцами в отношенииметаболической активности CYP 2D6 нет (р > 0,05 ).5. Было изучено изменение активности CYP 2D6 у пациентов при приемеингибитора активности данного изофермента галоперидола. В результате приемаингибитора наблюдали снижение метаболического индекса, что указывает наснижение активности изофермента. После проведения статистической обработкибыла доказана достоверность полученных данных786. Полученные данные по оценке активность изофермента CYP 2D6 упациентов с алкогольным гепатитом по сравнению с контрольной группой иснижение метаболического отношения после приема индуктора галоперидолапозволяют сделать вывод о возможности применения разработанной методики упациентов, принимающих ингибиторы изофермента CYP 2D6.79СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.

Абдрашитов Р.Х. Количественное определение пинолина для определенияактивностиизоферментовцитохромаР450//Сборникматериаловмеждународного симпозиума посвященный 5-летию Клинико-диагностическогоцентра Международного Казахско-Турецкого Университета им. Ахмеда Ясауи«Инновации в оказании скорой неотложной медицинской помощи и актуальныевопросы медицины». – г. Туркестан, Казахстан, 2014. – С. 214-216.2. Абдрашитов Р.Х. Разработка количественного определения пинолина дляоценки активности изофермента CYP 2D6 цитохрома Р450 методом LC/MS/MS //Сборник материалов IV Всероссийской научной конференции студентов иаспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциалбудущего», Санкт-Петербург, 14-15 апреля 2014 г.