Диссертация (Разработка методик количественного определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS), страница 10

Оценка предела количественного определенияНижний предел количественного определения – минимальная концентрацияанализируемого вещества в образце, которая может быть определена с требуемойправильностьюипрецизионностью;критериемпределаколичественногоопределения служило соотношение «сигнал : уровень флуктуационных шумов64нулевой линии» не менее 10 : 1. Фактически в рамках представленногоисследования в плазме крови предел количественного определения пинолинасоставил 250 пг/мл и для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина тожесоставил 250 пг/мл.

В моче предел количественного определения пинолинасоставил 250 пг/мл и для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина тожесоставил 250 пг/мл3.2.1.5. Эффект матрицыВлияние компонентов биологической матрицы (сыворотки крови и мочи)оценивали путём определения степени извлечения пинолина и его метаболита измодельных смесей, приготовленных аналогично калибровочным образцам иобразцам контроля качества, с концентрациями, соответствующими 250 пг/мл,750 пг/мл и 1500 пг/мл (для каждой из указанных концентраций исследовали 5независимых модельных смесей). За 100 % принимали раствор вещества вэкстрагентесаналогичнойконцентрацией,споправкойнастепеньконцентрирования при пробоподготовке.

Степень извлечения рассчитывали, каквыраженное в процентах соотношение площадей пиков определяемых веществ,полученных при хроматографическом исследовании экстрактов модельныхсмесей и растворов в чистом экстрагенте. Результаты приведены в таблице 18, 19,20, 21.Концентрация пинолинав модельной смеси, пг/млСтепень извлечения, %Коэффициентвариации, %25086,0211,0975084,6710,07150080,3112,04Таблица 18 - Степень извлечения пинолина из модельных смесей на плазме крови.65Концентрация6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболинав модельной смеси, пг/млСтепень извлечения,Коэффициент%вариации, %25083,9312,2275086,288,89150081,7210,13Таблица 19 - Степень извлечения 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина измодельных смесей на плазме крови.Концентрация пинолинав модельной смеси, пг/млСтепень извлечения, %Коэффициентвариации, %25084,169,5275083,1310,14150082,3210,37Таблица 20 - Степень извлечения пинолина из модельных смесей на моче.Концентрация6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболинав модельной смеси, пг/млСтепень извлечения,Коэффициент%вариации, %25079,3310,1975081,7111,05150083,3410,78Таблица 21 - Степень извлечения 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина измодельных смесей на моче.Полученныезначениясоответствуютпредъявляемымтребованиям,поскольку степень извлечения не превышает 100% и является воспроизводимой:коэффициент вариации рассматриваемого показателя не превышает 15%.663.2.1.6.

Стабильность анализируемых веществОценивалась стабильность анализируемого вещества в составе стандартныхрастворов,биологическойматрицыприхранении,атакжепослепробоподготовки.3.2.1.6.1. Стабильность стандартного раствораСтабильностьстандартногохроматографическогосоответствующихраствораисследованияконцентрациямпослеобразцовоценивалиразведенияконтролядопутёмегоконцентраций,качества;указанноеразведение учитывали в дальнейшем при расчёте концентраций. Оценивалистабильность в течение 1 недели, анализируя раствор на начало и окончаниеуказанногопериода.Исследовалипо3независимыхобразцовкаждойконцентрации. Результаты представлены в таблице 22, 23.Фактическая концентрацияпинолина в стандартном растворе, пг/млНачало периодаСреднее значениеОкончаниепериодаСтандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %Начало периода1500 7502501438 7372441383 6972180,730,43 0,25Окончание периода 1,210,48 0,17Начало периода4,41 10,261,50Окончание периода 2,48 5,11 7,79Таблица 22 - Стабильность стандартных растворов пинолина.Фактическая концентрация 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболина в стандартном растворе,1500 750 250пг/млНачало периода1427 714 229Среднее значениеОкончание периода1391 695 206Стандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %Начало периода0,810,52 0,23Окончание периода1,270,59 0,14Начало периода1,584,21 9,86Окончание периода2,54 4,97 7,28Таблица 23 - Стабильность стандартных растворов 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроβ-карболина.67Полученные данные свидетельствуют о том, что стандартный растворпинолина и его метаболита стабилен при хранении в течение не менее 1 недели.3.2.1.6.2.

Стабильность пинолина и его метаболита в составе биологическойматрицы при хранении в замороженном состоянииДля оценки стабильности анализируемого вещества в составе плазмы прихранении в замороженном состоянии готовили образцы, аналогичные по составуобразцам контроля качества. Половину образцов анализировали сразу послеприготовления, а остальные – после хранения в замороженном состоянии втечение 3 недель. Исследовали по 3 независимых образца каждой концентрации.Результаты представлены в таблице 24, 25, 26, 27.Фактическая концентрацияпинолина в образце, пг/млСреднее значениеСтандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %1500 750250Начало периода1484 735239Окончание периода1473 703229Начало периода0,53 0,28 0,05Окончание периода0,65 0,08 0,02Начало периода1,09 3,04 1,51Окончание периода1,35 0,72 0,43Таблица 24 - Стабильность пинолина при хранении в составе плазмы.Фактическая концентрация 6-гидрокси-1,2,3,4тетрагидро-β-карболина в образце, пг/мл1500 750250Начало периода1474 734241Окончание периода1427 711235Начало периода0,51 0,27 0,07Окончание периода0,63 0,06 0,04Начало периода1,07 3,07 1,53Окончание периода1,32 0,71 0,44Среднее значениеСтандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %Таблица 25 - Стабильность 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина прихранении в составе плазмы.68Фактическая концентрация1500 7502501477 729237Окончание периода 1438 713229пинолина в образце, пг/млНачало периодаСреднее значениеНачало периода0,61 0,37 0,19Окончание периода0,73 0,18 0,12Относительное стандартноеНачало периода1,11 3,14 1,62отклонение, %Окончание периода1,28 0,84 0,47Стандартное отклонениеТаблица 26 - Стабильность пинолина при хранении в составе мочи.Фактическая концентрация 6-гидрокси-1,2,3,4-1500 750250Начало периода1467 736241Окончание периода1432 711226Начало периода0,60 0,35 0,17Окончание периода0,76 0,19 0,13Относительное стандартноеНачало периода1,12 3,16 1,61отклонение, %Окончание периода1,27 0,82 0,45тетрагидро-β-карболина в образце, пг/млСреднее значениеСтандартное отклонениеТаблица 27 - Стабильность 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина прихранении в составе мочи.Полученные данные свидетельствуют о том, что пинолин и его метаболитстабильны в составе плазмы и мочи при хранении в замороженном состоянии втечение не менее 3 недель.3.2.1.6.3.

Стабильность пинолина и его метаболита после пробоподготовкиДляоценкистабильностипинолинаиегометаболитапослепробоподготовки исследовали экстракты, полученные из образцов контролякачества. Половину экстрактов анализировали сразу после получения, аостальные экстракты – после хранения в холодильнике (+4ºС) в течение 1 нелели.69Исследовали по 3 независимых образца каждой концентрации. Результатыпредставлены в таблице 28, 29, 30, 31.Фактическая концентрация1500 7502501475 738242Окончание периода 1429 701231пинолина в образце, пг/млСреднее значениеНачало периодаНачало периода0,55 0,36 0,12Окончание периода0,70 0,18 0,08Относительное стандартноеНачало периода1,13 3,15 1,58отклонение, %Окончание периода1,26 0,84 0,44Стандартное отклонениеТаблица 28 - Стабильность пинолина при хранении в составе экстрактов,полученных из плазмы кровиФактическая концентрация 6-гидрокси-1,2,3,4-1500 750250Начало периода1478 740238Окончание периода1427 712221Начало периода0,53 0,33 0,14Окончание периода0,68 0,17 0,09Относительное стандартноеНачало периода1,03 3,17 1,60отклонение, %Окончание периода1,16 0,81 0,51тетрагидро-β-карболина в образце, пг/млСреднее значениеСтандартное отклонениеТаблица 29 - Стабильность 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина прихранении в составе экстрактов, полученных из плазмы крови.70Фактическая концентрация1500 750250Начало периода1474 736239Окончание периода1421 708220Начало периода0,52 0,34 0,16Окончание периода0,67 0,16 0,10Относительное стандартноеНачало периода1,04 3,18 1,61отклонение, %Окончание периода1,15 0,80 0,50пинолина в образце, пг/млСреднее значениеСтандартное отклонениеТаблица 30 - Стабильность пинолина при хранении в составе экстрактов,полученных из мочиФактическая концентрация 6-гидрокси-1,2,3,4-1500 750250Начало периода1474 736237Окончание периода1420 706225Начало периода0,49 0,36 0,12Окончание периода0,62 0,15 0,07Относительное стандартноеНачало периода1,07 3,17 1,60отклонение, %Окончание периода1,19 0,83 0,52тетрагидро-β-карболина в образце, пг/млСреднее значениеСтандартное отклонениеТаблица 3 -.

Стабильность 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина прихранении в составе экстрактов, полученных из мочи3.2.1.7. Тест на разведениеИзучена возможность количественного определения целевого аналита вконцентрациях, превышающих верхний предел диапазона калибровки. Для этихцелей готовили модельные образцы с концентрацией пинолина и его метаболита 2нг/мл. Исследовали 3 независимых образца каждой концентрации. Образцыразводили в 2 раза бланковой сывороткой и мочой. Результаты представлены втаблице 32, 33.71Состав образцаПинолин,6-гидрокси-1,2,3,4-2000 пг/млтетрагидро-βкарболин, 2000 пг/млРезультаты исследованияразведённых образцов(с учётом фактора разведения 2),186818573,623,531,261,17-4,37-4,25среднее значение, пг/млСтандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %Относительная погрешность, %Таблица 32 - Результаты теста на разведение бланковой сывороткой.Состав образцаПинолин,6-гидрокси-1,2,3,4-2000 пг/млтетрагидро-βкарболин, 2000 пг/млРезультаты исследованияразведённых образцов(с учётом фактора разведения 2),188718603,263,381,531,35-4,56-4,35среднее значение, пг/млСтандартное отклонениеОтносительное стандартноеотклонение, %Относительная погрешность, %Таблица 33 - Результаты теста на разведение бланковой мочой.Полученныеколичественногорезультатыопределенияуказываютпинолинаикарболина после разведения исходных образцов.надостаточнуюточность6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-723.3.