Автореферат (Исследования по разработке и стандартизации комплексного урологического растительного средства), страница 3

«Об утверждении правил лабораторнойпрактики» и Правилам, принятым «Европейской конвенцией о защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST №123»от 18.03.1986 (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этическойкомиссией Института общей и экспериментальной биологии Сибирского отделенияРАН (протокол №6 от 25.10.2016). Методом мгновенной декапитации осуществлялиэвтаназию животных под легким эфирным наркозом.Экспериментальнуюмодельуролитиазавоспроизводилипутемвведениявнутрижелудочно витамина Д2 в дозе 12000 ЕД/кг массы 1 раз в сутки в течение 20дней (контроль) по методу Higgens H.G.

(1965). Одновременно с введением витаминаД2 животным опытной группы интрагастрально вводили отвар изучаемого сбора вобъеме 10 мл/кг один раз в сутки с начала эксперимента и на протяжении 20 дней.Водное извлечение испытуемого средства готовили по требованиям ГФ РФ XIII изд.,ОФС.1.4.1.0018.15.Функциональное состояние почек у животных оценивалось по определению:диуреза без нагрузки по общепринятому методу и с 2,5% водной нагрузкой;концентрации катионов калия, натрия и кальция в моче – методом пламеннойфотометрии на приборе «Flapho – 4»; концентрации фосфора – по Хаями Тадаси.Депурационную функцию почек оценивали по содержанию креатинина и мочевины всыворотке крови и моче – унифицированными методами с использованием наборовреактивов Био-Ла-Тест «Лахема»; содержание белка в моче – по реакции ссульфосалициловой кислотой; оценку скорости клубочковой фильтрации – по12клиренсу эндогенного креатинина; рН мочи на универсальном иономере ЭВ – 74 сиспользованием приспособления для малых объёмов.

Для определения минутногодиуреза осуществляли сбор мочи в течение 3 часов в обменных клетках, которыепредставляют собой металлические цилиндры с перфорированным дном и воронкой,предназначенной для стока собираемой мочи. Для определения концентрациималонового диальдегида в сыворотке крови и в гомогенате почек была использованаметодика, основанная на реакции взаимодействия малонового диальдегида стиобарбитуровой кислотой и последующем спектрофотометрировании образованногоокрашенного комплекса при длине волны 532 нм и 580 нм. Спектрофотометрическимметодомопределялиактивностькаталазысывороткикрови.Полученныеэкспериментальные данные статистически обработаны общепринятыми методами.Результаты разработки состава сбораДля разрабатываемого комплексного урологического растительного средства быловыбрано лекарственное растительное сырьё (ЛРС), традиционно используемое призаболеваниях мочевыводящих путей.

ЛРС, входящее в сбор, давно и успешноиспользуется в официнальной медицине, как мочегонное, спазмолитическое,антисептическое, противовоспалительное, желчегонное средство.В соответствии с утвержденными нормативными документами виды ЛРС,входящего в сбор, стандартизуются по следующим показателям (табл. 1):Таблица 1Количественное определение БАВ видов ЛРС сбора, регламентируемоенормативными документамиЛРСНДКоличественное определениеЛистья брусникиХвоща полевоготраваГФ XIГФ РФ XIIIЛопуха корниГФ РФ XIIIАрбутин (йодометрия)Сумма флавоноидов в пересчете на кверцетин(СФМ)1.

Сумма полисахаридов в пересчете нафруктозу (СФМ)2. Экстрактивные вещества, извлекаемыеводойУкропа пахучегоплодыТрава полыниобыкновеннойГФ РФ XIIIЭфирное масло (перегонка с водяным паром)ФС 42-2094-83ОтсутствуетДля выбора оптимального соотношения компонентов прописи, нами были изучены5 составов сбора (табл. 2), которые оценивались по количественному содержаниюэкстрактивных веществ, извлекаемых водой. Результаты представлены в табл.

3.13Таблица 2Варианты состава сбора№п/пНаименование компонентовсбора12345Листья брусникиТрава хвоща полевогоКорни лопухаПлоды укропа огородногоТрава полыни обыкновеннойитогоСостав сборов(количество входящих компонентов, г)1234530,030,015,015,010,0100,020,020,030,020,010,0100,030,020,020,020,010,0100,030,010,030,020,010,0100,035,020,020,020,05,0100,0Таблица 3Результаты определения содержания экстрактивных веществ составов сбораСодержание экстрактивных веществ, извлекаемыхводой, % (n=10, р=0,95)23,17±0,4921,64±0,4722,28±0,3922,96±0,4321,16±0,35Состав сбора12345На основании проведенных исследований был выбран состав сбора №1, так как внем содержится наибольшее количество водорастворимых экстрактивных веществ.На экспериментальной модели оксалатного уролитиаза, которую получали путемвнутрижелудочноговведениякрысамвитаминаД 2,провелиизучениефармакологических эффектов водного извлечения сбора (табл.

4).Таблица 4Фармакологические эффекты сбора №1 (экспериментальный уролитиаз,индуцированный введением витамина Д2)Объект исследованияСбор №1ПолученныерезультатыФармакологические эффектыдиуретическийсалуретическийпротивовоспалительныйнефропротекторныйнормализующий фосфорно-кальциевый обменантиоксидантныйлитолитический(табл.4)характеризуютширокийспектрфармакологических эффектов у изучаемого сбора, что позволяет рекомендовать его14для лечения и профилактики мочекаменной болезни.

Для дальнейших исследованийсоставу сбора №1 было присвоено условное название «Фитоурол».Изучение морфолого-анатомических признаков сбораИзучаемый сбор исследовали визуально, а также с помощью лупы (10×) истереомикроскопа (15×) (рис. 1, 2, 3).Сбор«Фитоурол»представляетсобойсмесьнеоднородныхкусочковрастительного сырья: измельчённых листьев, стеблей, соцветий, корней и цельныхплодов, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм.

Цвет желтоватокоричневато-зелёный со светло-зелёными и тёмно-коричневыми вкраплениями. Запахслабый своеобразный. Вкус водного извлечения горьковатый слегка пряный.Рисунок 2 – Внешний видцельных плодов укропаогородного (40×):Полуплодики: с внутреннейи наружной стороны и нераспавшийся вислоплодникРисунок 1– Внешний вид сбора1234567815913101411121516Рисунок 3 – Микропрепараты компонентов сбора «Фитоурол»:Брусники листья: (1) – верхний эпидермис (280×); (2) – нижний эпидермис (280×); (3) –нижний эпидермис с устьицами парацитного типа (400×); (4) – нижний эпидермис сжелёзкой (63×). Хвоща полевого трава: (5) – эпидермис ребер стеблей и ветвей (280×);(6) – эпидермис бороздок стеблей и ветвей, устьица (280×); (7) – выросты гребней реберстеблей (100×); (8) – фрагмент зубчика (редуцированный лист) (100×).

Полыниобыкновенной трава: (9) – верхний эпидермис, Т-образный волосок на жилке (280×);(10) – нижний эпидермис, головчатый и Т-образный волосок (280×); (11) – цветок спыльниками (56×); (12) – листочек обвёртки (56×); (13) – желёзки на покрове бутона(280×). Лопуха корни (давленый препарат): (14) – пробка (56×); (15) – сосудистые тяжи(63×); (16) – капли жирного масла в клетках паренхимы коры (Судан III) (280×).Таким образом, при изучении внешнего вида сбора «Фитоурол» были определеныего диагностические признаки. Описаны и визуализированы микродиагностическиепризнаки компонентов сбора.Изучение состава БАВ сбора и его стандартизацияПри помощи методов УФ-спектрофотометрии, ТСХ и также качественнымиреакциями, установлено и подтверждено наличие основных БАВ, входящих в составЛРС сбора: флавоноидов (рутин, гиперозид, лютеолин, кверцетин, лютеолин-7гликозид, нарингенин), фенолкарбоновой кислоты (галловая), гидроксикоричныхкислот (хлорогеновая, феруловая), свободных сахаров (сахароза, глюкоза, фруктоза),фенологликозида (арбутин), дубильных веществ и полисахаридов (инулин).С использованием ВЭЖХ-анализа фенольных соединений в сборе былиподтверждены ранее идентифицированые, а также установлены: фенолкарбоноваякислота (эллаговая); гидроксикоричные кислоты (неохлорогеновая, изоферуловая,16кофейная, цикориевая, коричная(эпикатехин,катехин,кислоты); производныеэпигаллокатехингаллат);дубильных веществкумарины(дикумарин,метоксикумарин) (табл.

5).Таблица 5Компонентный состав фенольных соединений сбора «Фитоурол»определенный методом ВЭЖХ№п/п1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33.КомпонентАрбутинНеидентифиц.Галловая к-таКатехинНеидентифиц.ЭГКГаллатНеидентифиц.ЭпикатехинХлорогеновая к-таЦикориевая к-таНеидентифиц.Кофейная к-таНеидентифиц.Неохлорогеновая к-таНеидентифиц.ДикумаринФеруловая к-таИзоферуловая к-таНеидентифиц.Неидентифиц.Лютеолин-7-гликозидГиперозидРутинНеидентифиц.Неидентифиц.Неидентифиц.Эллаговая к-таНеидентифиц.Коричная к-тао-метоксикумаринНарингенинКверцетинЛютеолинВремя удерживания,мин3,5433,8784,0724,5414,7184,9865,1465,3375,7596,0216,2486,8297,4147,758,4059,43210,3311,4712,1413,1616,0618,6619,3922,2524,2825,8126,6227,9831,2934,4439,5145,6951,61Высота пика,mV750,23353,71485,42219,65200,92278,92293,81216,18136,84131,34161,40120,1761,7565,0876,2537,3343,1944,8640,4784,92160,8583,5576,6688,4775,5264,7764,9161,6750,7838,7141,8158,6921,70Площадь пика,mV*сек13571,883021,638342,633576,671642,303753,883772,912920,522667,541595,124090,543652,421132,441941,113578,121569,261706,492302,841452,854860,7116032,538130,765996,249720,988531,893518,885893,489245,058452,206261,2812778,9718180,925202,74В водном извлечении сбора «Фитоурол» методом ВЭЖХ также определеноприсутствие органических кислот (янтарная, щавелевая кислоты) и свободных сахаров(фруктоза, глюкоза).17С использованием метода ГЖХ в составе эфирного масла, полученного из сбора,установлены: лимонен, камфора, гераниол, анетол, борнилацетат.В сборе «Фитурол» было определено содержание экстрактивных веществ,извлекаемых водой, и основных групп БАВ (табл.

6):Таблица 6Количественное содержание экстрактивных и БАВ в изучаемом сборе(n=5, р=0,95)Суммаорганическихкислот121,20,461,391,770,36223,70,471,491,720,34321,10,451,481,830,33422,70,471,351,840,35523,10,481,411,740,33среднее 22,36±1,44 0,466±0,01 1,42±0,07 1,78±0,06 0,34±0,02СуммадубильныхвеществЭфирное маслоСуммаполисахаридов(инулин)АрбутинСуммафлавоноидов№Экстрактивныевещества,извлекаемыеводойСодержание, %3,383,433,393,343,333,37±0,051,021,071,101,071,031,06±0,04Проведенные исследования позволили определить, что в образцах сбора«Фитоурол» количественное содержание экстрактивных веществ варьирует от 21,1 до23,7%, флавоноидов от 0,45 до 0,48%, арбутина от 1,35 до 1,49%, полисахаридов(инулин) от 1,72 до 1,84%, эфирного масла от 0,33 до 0,36%, дубильных веществ от 3,33до 3,43%, органических кислот от 1,02 до 1,10%.С учетом фармакологической направленности изучаемого сбора, целесообразно,проводить стандартизацию по количественному содержанию суммы флавоноидов иарбутина.

Исходя из того, что сбор «Фитоурол» предназначен для приготовленияводных извлечений, то рационально проводить стандартизацию по содержаниюэкстрактивных веществ, извлекаемых водой. С учетом полученных данных ирезультатов статистического анализа, в качестве норматива предложено установитьсодержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 21%, содержаниесуммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид не менее 0,4%, содержаниеарбутина – не менее 1,3%.18Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов всбореДля количественного определения суммы флавоноидов в изучаемом сборе былаиспользованаспектрофотометрическаяметодика,основаннаянареакциикомплексообразования флавоноидов с алюминием хлоридом.