Автореферат (Диагностическое значение анализа матриксных металлопротеиназ у детей с расщелиной губы и неба), страница 2

Также повторное взятие образца материала для исследования, было проведено упациентов,госпитализированныхдляпроведенияуранопластикипослепервичной хейлопластики.Иммуноферментный анализ ММП2, ММП3, ТИМП2, TGFβ2.Для проведения иммуноферментного анализа необходимо было получитьинформированное согласие родителей, так как нам необходимо было проводитьбиопсиюмягкихтканей.Дляпроведенияиммуноферментногоанализанеобходимо было провести биопсию мягких тканей у всех 84 пациентов. Укаждого пациента с расщелиной губы и неба биопсия была проведена дважды.8Первая биопсия была проведена в области патологии (рис.

1,2,3,4 отмеченознаком плюс), вторая биопсия была проведена вне зоны патологии (рис.1,2,3,4отмечено знаком минус).Рисунок 1 – Зоны биопсии при расщелине губы. Знак плюс – очаг патологии,знак минус – вне очага патологии.Вторая биопсия была проведена вне зоны патологии в связи с тем, что ткань вэтой области не изменена патологическим состоянием, и структура ее ненарушена, одновременно с этим вторая биопсия являлась контролем впроводимом иммуноферментном анализе.

Размер мягких тканей, полученных входе биопсии составлял приблизительно 2 на 2 миллиметра или размером вспичечную головку.Рисунок 2 – Зоны биопсии при расщелине губы, во время оперативноговмешательства – хейлопластика. Знак плюс – очаг патологии, знак минус – внеочага патологии.9Рисунок 3 – Зоны биопсии во время оперативного вмешательства приуранопластике. Знак плюс – очаг патологии, знак минус – вне очага патологии.Рисунок 4 – Зоны биопсии после окончания оперативного вмешательства.

Знакплюс – очаг патологии, знак минус – вне очага патологии.Образцы мягких тканей, полученные в ходе биопсии, помещались вполипропиленовые пробирки (рис. 5) с 1мл физиологического раствора во времяоперации и сразу же помещались в холодильник и хранились при температуре 2–8°. Каждую пробирку маркировали знаком плюс или минус, где плюс означалобразец из зоны патологии, а минус образец, взятый вне зоны патологии.

Такжена пробирке подписывались фамилией и клиническим диагнозом пациента.Рисунок 5 – Хранение материала биопсии мягких тканей.10Холодильник располагался в лаборатории патологический физиологииНаучного центра здоровья детей. Из материала полученного в ходе биопсииполучали супернатант (Рисунок 6) в кратчайшие сроки. Супернатант хранилсяпри температуре –80°. Срок хранения материала составлял от трех лет до трехмесяцев. Из истории болезни, у пациентов, которые принимали участие висследовании, была выписана информация приемного отделения, информация ооперативном вмешательстве, информация первичного обследования, анамнезжизни, анамнез заболевания, данные при рождении. Полученная информациясистематизировалась в таблице.Рисунок 6 – Определение супернатанта.Для исследования необходимо было приготовление супернатанта изполученных, в ходе биопсии мягких тканей.

Приготовление супернатантапроводилось в течении 1–3 дней с момента оперативного вмешательства. Послеполучения супернатанта в нем определено количество белка на 1 мл объема. длядальнейшего исследования штатив с образами отправлен в Центр крови ПервогоМосковского государственного медицинского университета им. И.М.

Сеченова. впереносном холодильникеДля иммуноферментного анализа использованы реактивы ведущихмировых производителей такие как: HumanТИМП–2 QuantikineELISAKit –RnDSystems,HumanММП–2QuantikineELISAKit–RnDSystems,Bio–PlexProTGF–β Panel, 3–PlexBio–RadLaboratories, AESKULISAММП3, (рис 7).11Статистическая обработка полученных результатов.Статистический анализ фактических данных проводился с использованиемпрограммы IBM SPSS Statistics 21.0.

Доверительные границы для частотырассчитывались на основе биномиального распределения. Достоверностьразличия частот определялась при помощи критерия «хи–квадрат», для таблиц 2на 2 – в точном решении Фишера. Для числовых показателей рассчитывалисреднее арифметическое M, среднеквадратичное отклонение, статистическуюпогрешность среднего m, медиану Me, а также минимум, максимум и квартили.Достоверность различия среднего между группами определяли при помощидисперсионного анализа, связь между числовыми показателями искали припомощи корреляции Пирсона.

Для большей показательности для рядабиохимических показателей наряду с их исходными значениями использовалилогарифм значений.Ввидунекомпактностираспределениярядапоказателейтакжеиспользовали методы непараметрической статистики» критерии Колмогорова–Смирнова и Манн–Уитни и коэффициент ранговой корреляции Спирмена.Различия считали статистически достоверными (статистически значимыми) приp <0,05.Иммуноферментный анализ матриксных металлопротеиназ 2 типа в мягкихтканях при различных типах расщелины губы и неба.Содержание ММП2 в биопсии мягких тканях оценено у 84 пациентов срасщелиной губы и неба или расщелиной губы.ММП2 из зоны расщелины имеет значения от 0,07 до 26,83 нг/мл, гдесреднее значение равно 1,57 нг/мл, 75% значений меньше или равно 4,29 нг/мл,25% равно или ниже 0,45нг/мл. Содержание ММП2 в зоне патологии колебалосьот 0,074 нг/мл до 26,829 нг/мл.

ММП2 из зоны без патологии имеет значения от0,02 до 20,17 нг/мл, где среднее значение равно 0,59 нг/мл, 75% значений меньшеили равно 2,05 нг/мл, 25% равно или ниже 0,30 нг/мл.12Установлено, что при РГН количество ММП2 в мягких тканях, отличаетсяв зоне патологии. Наблюдается достоверный рост по всем рассматриваемымферментам, от небольшого увеличения до увеличения в несколько раз. Широкийразброс объясняется различным состоянием соединительной ткани при разныхвидах патологии, тяжестью общего состояния при различных типах РГН,травматичностью и количеством белка в образце.Таблица 1 – Медианы биохимических показателей при различных типахпатологии (НП – нет патологии).ММП2 нг/млММП2 нг/млНПДвусторонняя расщелина (n35)5,092,64Односторонняя (n=34)3,952,6Расщелина губы (n=8)1,010,9Частичная расщелина неба (n=7)1,40,97Таким образом, показатели ММП2 (табл.

1) области расщелиныдостоверно отличались от зоны вне расщелины (p>0,01).Наивысший показатель уровня ММП2 зафиксирован в зоне расщелины придвусторонней расщелине губы и неба. При других типах патологии показателитак же заметно были выше чем в образцах вне расщелины.13Различия медианы ММП2 в мягких тканях изобласти патологии при различных типах РГН6543210Двусторонняярасщелина (n35)Односторонняя(n=34)ММР2 нг/млРасщелина губы (n=8) Частичная расщелинанеба (n=7)ММР2 нг/млНПРисунок 7 – Медианы содержания ММП2 при различных типах патологии РГН(НП – нет патологии).Кроме максимальных значений ММП2 при двусторонней расщелине губыи неба, оценили так же содержание данных параметров для других типоврассматриваемой патологии (рис. 7).Таким образом по результатам проведенного иммуноферментного анализаММП2 в мягких тканях при различных типах РГН мы сделали следующиевыводы:– Экспрессия ММП2 достоверно повышалась при всех типах РГН в мягкихтканях, взятых из зоны патологии по сравнению с тканями, взятыми в зоне внепатологии (р <0,001).– Наибольшей экспрессия ММП2 была при двусторонней расщелине губы инеба, наименьшей при частичной расщелине губы, при которой показателиММП2 лишь незначительно увеличивались (рис.

7).Иммуноферментный анализ матрисксных металлопротеиназ 3 типа вмягких тканях при различных типах расщелины губы и неба.В биопсии всех прооперированных детей наблюдалось разное по степенивыраженности содержания ММП3. А так же в супернатанте содержалось разноеколичество белка. Расчеты содержания ММП3, велись с учетом отношения14количества биохимических показателей к количеству белка. Соответствующиерасчеты были проведены и для материала полученного в ходе биопсии из зоны спатологией для сравнения с зоной без патологии.ММП3 из зоны расщелины имеет значения от 0,05 до 16,48 нг/мл, гдесреднее значение равно 1,45 нг/мл, 75% значений меньше или равно 3,53 нг/мл,25% равно или ниже 0,50 нг/мл.ММП3 из зоны без патологии имеет значения от0,02 до 13,38 нг/мл, где среднее значение равно 0,72 нг/мл, 75% значений меньшеили равно 1,78 нг/мл, 25% равно или ниже 0,21 нг/мл.Установлено, что при РГН количество ММП3, отличаются в зонепатологии от количества в зоне без патологии.

Содержание ММП3 в зонепатологии колебалось от 0,054 нг/мл до 16,479 нг/мл.Таблица 2 – Медианы ММП3 в мягких тканях при различных типах патологии(НП – нет патологии).ММП3 нг/мл ММП3 нг/млНПДвусторонняя расщелина (n35)3,371,66Односторонняя (n=34)31,54Расщелина губы (n=8)21,881,490,87Частичная(n=7)расщелинанебаИз таблицы 2 следует, что достоверное увеличение концентрации, ММП3,по медианам при двусторонней расщелине губы и неба, что является наивысшимпоказателем среди других видов патологии.При частичной расщелине неба медиана содержания ММП3 в областипатологии равнялось 1,49 нг/мл, что было меньше чем при расщелине губы,односторонней и двусторонней расщелине губы и неба.Максимальнымсодержание ММП3 в мягких тканях при частичной расщелине неба из зоны15патологии составляло 4,146 нг/мл, а из зоны без патологии составляло 1,576нг/мл.Различия медианы ММП3 в мягких тканях из зоныпатологии при различных типах РГН43,532,521,510,50Двусторонняярасщелина (n35)Односторонняя (n=34) Расщелина губы (n=8) Частичная расщелинанеба (n=7)ММР3 нг/млММР3 нг/млНПРисунок 8 – Медианы ММП3 при различных типах расщелины губы и неба (НП– нет патологии).Максимальное значение медианы для ММП3 было в зоне патологии придвусторонней расщелине губы и неба у 35 пациентов 3,373 нг/мл.