Автореферат (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 2

В то же время отсутствуетотчётливаязакономерность в изменении синтетической активностинейронов различных ядер при болезни Альцгеймера. При сосудистомслабоумии в структурах гипоталамуса и передне-базального мозга, восновном наблюдается тенденция к снижению метаболическойактивности нейронов.2. Экспрессия эстрогенового рецептора  увеличивается в гипоталамусе ипередне-базальном мозге при болезни Альцгеймера.3. В гипоталамусе человека находятся мутантные формы эстрогеновогорецептора альфа, которые могут экспрессироваться на уровне белка.4.

Локальныйгипоталамусауровеньсинтезапри болезниэстрогеноввбольшинствеядерАльцгеймера снижается. Измененияэкспрессии ароматазы при болезни Альцгеймера и сосудистомслабоумии идентичны в крупноклеточных структурах гипоталамуса(СОЯ) и передне-базального мозга (БЯМ), в которых при старениивыявлено увеличение содержания этого фермента.Апробация работыМатериалы исследования докладывались на 6 Всероссийских и 6международных научных конференциях: «Структурно-функциональные инейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга - 2005,2006 и 2007г (г. Москва); международной конференции «Рецепторы и7внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011 и 2013гг.), XIII конгрессемеждународной ассоциации морфологов (2016г., г.

Петрозаводск), 2-ой, 3-ейи 4-ой международных конференциях «Стероиды и нервная система» в г.Турине (Италия) в 2003, 2005 и 2007г., 8-м Европейском конгрессенейропатологов «Нейропатология-2005» в г. Амстердаме (Нидерланды) в2005г., международном симпозиуме по вопросам менопаузы в г. Амстердаме(Нидерланды) в 2007г. и на международной конференции ассоциации поизучению болезни Альцгеймера в Париже (Франция) в 2011г.Публикация результатов исследованияОсновные положения работы изложены в 33 научных публикациях. 8статей опубликовано в Российских журналах из перечня рецензируемыхнаучных изданий ВАК, включая 4 статьи в рецензируемых научныхизданиях, входящих в международные реферативные базы данных и системыцитирования. 12 статей опубликованы в зарубежных изданиях, включённых всистему цитирования Web of Sciences: Science Citation Index Expanded.Объём и структура диссертацииДиссертация изложена на 284 страницах машинописного текста исостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,результатовсобственныхисследований,обсужденияполученныхрезультатов, выводов и указателя литературы.

Иллюстративный материалпредставлен38фотомонтажами,таблицами,графиками,40включающими1614диаграммами,микрофотографию.43Указательлитературы включает 107 отечественных и 412 зарубежных источников.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯОбщая характеристика материала исследованияИсследования проведены на посмертном материале мозга 95 человек приналичии соответствующего разрешения на аутопсию мозга и использованиеткани мозга и медицинской информации в научных целях.

У контрольныхслучаевпризнаковкогнитивныхнарушений,неврологическихипсихиатрических расстройств не выявлено. По данным аутопсии в этой8когорте отсутствовали изменения, которые могли бы быть отнесены к какойлибо патологии мозга. Эту группу разделили на подгруппы до и после 50 лет,т. е. среднего возраста менопаузы у женщин и начала андропаузы у мужчин(Prelevic and Jacobs, 1997). Диагноз болезни Альцгеймера был поставлен приисключении других возможных причин деменции на основании историиболезни, медицинского обследования и лабораторных тестов согласнокритериямНациональногоИнститутаНеврологическихиКоммуникационных Расстройств и Ассоциации по изучению Инсультов,болезни Альцгеймера и относящихся к ним заболеваний (NINCDS-ADRDA)(McKhann et al., 1984).

Степень тяжести деменции оценивалась по шкалеРейсберга (Reisberg et al., 1982). Клинический диагноз болезни Альцгеймерабыл подтвержден нейропатологическим исследованием, в результатекоторого у случаев с болезнью Альцгеймера обнаружены множественныесенильные бляшки, нейрофибриллярные клубки и дистрофичные нейриты вновойкореигиппокампе.Нейропатологсистематическиизучилраспределение нейропатологических проявлений в мозге при БоАл иопределил их выраженность по шкале от 0 до 6 согласно классификацииБраак (Braak and Braak, 1991). У пациентов с БоАл степень по шкале Брааксоставила 5-6, а у контрольных случаев 0-1.Диагноз СС был установлен на основании критериев NINDS-AIREN(Roman et al., 1993).

При нейропатологическом исследовании случаев с ССобнаружены следующие изменения: 1) атеросклероз крупных сосудовоснования мозга умеренной или выраженной степени, 2) диффузнорасширенные желудочки мозга, 3) лакуны, 4) «старые» или «недавние»инфаркты, 5) некротические повреждения и атрофия извилин и окружающегобелого вещества, 6) множественные кровоизлияния и их последствия, 7)разрежение и мацерация белого вещества, 8) état criblé в хвостатом ядре,покрышке, бледном шаре и таламусе. В височной, теменной, затылочной ииногда лобной коре, в поясной извилине, хвостатом ядре, покрышке,9бледном шаре, внутренней и наружной капсуле, мозжечке и мостеобнаруживались инфаркты.Участки головного мозга, содержащие базальное ядро Мейнерта,вертикальноеядродиагональногополяБрока,супраоптическое,инфундибулярное, вентромедиальное, туберомамиллярное и медиальноемамиллярное ядра, были зафиксированы в 4% растворе формальдегида вфосфатном буфере (pH 7.4) при комнатной температуре, дегидратированы вспиртах восходящей концентрации, залиты в парафин и порезаны насерийные фронтальные срезы толщиной 6 мкм.

С целью определениятопографии ядер каждый 50-й срез был окрашен 0.5% раствором тионина.Иммуноцитохимические исследованияВ парафиновых срезах гипоталамуса и передне-базального мозгапроводилось иммуноцитохимическое окрашивание: 1) аппарата Гольджи(АГ) с помощью поликлональных антител «анти-HG-130», распознающихспецифичный сиалогликопротеин средней цистерны АГ нейронов человека,пероксидазо-антипероксидазным методом; 2) эстрогеновых рецепторов  и поликлональными антителами фирмы «Santa Cruz» авидин биотиновымметодом; 3) сплайсингового варианта МВ1 поликлональными антителамипероксидазо-антипероксидазным методом; 4) ароматазы поликлональнымиантителами пероксидазо-антипероксидазным методом; 5) соматостатина сиспользованиемсоматостатинполиклональной1-12нейрофибриллярных(S320),антисыворотки,дляопределенияклубковраспознающейграницантителами,ВМЯ;6)выявляющимигиперфосфорилированный белок «тау» (AT8).

Специфичность антител к АГ,ароматазе и МВ1 подтверждена результатами западного блоттинга набелковом экстракте фрагментов замороженной гипоталамической области.Гибридизация in situ мРНК вазопрессинаГибридизацияin situ мРНК вазопрессина (ВП) проводилась встерильных условиях на срезах, содержащих дорсолатеральную часть СОЯ,контрольных случаев и доноров с СС. После депарафинирования,10регидратации и обработки в специальных буферах на каждый срезнаносилась меченая радиоактивной серой проба ВП, состоявшая из 48нуклеотидов, комплементарных основаниям 411-458 препровазопрессина.После 17-часовой инкубации при температуре 420С срезы промывались врастворахцитратнойАвторадиографическоесоли,ацетатапроявлениеаммонияпроизводилосьипослеэтанола.17-часовойэкспозиции на высокочувствительной плёнке Biomax MR-1.

Затем срезыбыли погружены в эмульсию, после 3-х дневной экспозиции обработаны впроявителе Dektol и фиксаторе Kodak, промыты в водопроводной воде,окрашены тионином, дегидратированы и заключены под покровные стёкла.Цепная реакция полимеразыЦепная реакция полимеразы (ЦПР) проводилась с целью определенияэкспрессии сплайсинговых вариантов мРНК эстрогенового рецептора (ЭР) в мамиллярных телах (МТ) контрольных случаев и доноров с БоАл.Экстракция мРНК осуществлялась из замороженных МТ с помощью Тризоласогласно инструкциям производителя. Реакции обратной транскрипциипроведены с 200 единицами обратной транскриптазы «Суперскрипт II» вобъёме 20 мкл в течение 90 минут при 420C для каждого случая.

2 мклкопированной ДНК были использованы в качестве исходного материала дляамплификации фрагментов 1) от первого до четвёртого экзона; 2) отчетвёртого до восьмого экзона; 3) от второго до пятого экзона; 4) от второгодо четвёртого экзона; 5) от третьего до пятого экзона. ЦПР проведены вобъёме 50 мкл, содержащем праймеры, азотистые основания, буфер, хлоридмагния и ДНК полимеразу. Продукты ЦПР помещались в 2% агарозный гельс последующим электрофорезом и визуализацией в ультрафиолетовом свете.Отчётливо оформленные полоски вырезались из геля стерильным лезвием сдальнейшим выделением из них ДНК.

Очищенная ДНК подвергалась реамплификации при тех же условиях с определением нуклеотиднойпоследовательности.Сцельюколичественнойоценкиэкспрессиивыявленных сплайсинговых вариантов следующая серия ЦПР проводилась в11объёме 20мкл, содержащем 0.1мкл кДНК и раствор для ЦПР сфлюоресцентным красителем «SYBR Green» и праймеры. Полученныерезультаты анализировались с учётом экспрессии референтных генов:рибосомального белка S27a (rS27a), фактора выпрямления 1 (EF1) и E2D 2убиквитин-конъюгирующего фермента Ube2d2. Относительные уровнитранскрипции определялись, исходя из первичных данных, по формуле:(эффективностьэкспрессиитранскриптовгенаЭР)–(порядокцикла)/(эффективность экспрессии референтных генов)–(порядок цикла).Морфометрический анализКоличественная оценка результатов морфологических исследованийосуществлялась главным образом с помощью компьютерной системыанализа изображений IBAS-KAT, соединенной с чёрно-белой камерой имикроскоп Zeiss.