Диссертация (Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на регенерацию печени после ее обширной резекции (экспериментальное исследование)), страница 10

Однако, действия данных факторов недостаточно для статистически значимого увеличения числа митозов,диаметра ядра, площади гепатоцитов или печеночной дольки.78УвеличениеколичестваPCNAпозитивныхклетокнафонетрансплантации ММСК отмечали и другие авторы [83; 178].В доступных источниках не было найдено работ касающихсявлияния ММСК после ОРП на такие показатели как: число митозов,диаметр ядра, площадь гепатоцита и печеночной дольки. Однако, как мыуже говорили ранее в других работах приоценки регенерации печениданные показатели учитывались [1; 21; 28; 36; 158]. Редкое применениеданныхпоказателейскореевсегосвязанострудоемкостьюморфометрического исследования.Таким образом, трансплантация аллогенных ММСК КМ не влияет наколичество митозов, диаметр ядра, площадь гепатоцитов и размерпеченочныхдолек,ноувеличиваетколичество(PCNA+) клеток после 70% резекции печени.пролиферирующих79ЗаключениеРезекция печени – основной метод лечения опухолей и метастазовпечени[130].Ссовершенствованиемразвитиемхирургическоймедицинскогометодики,оборудования,предоперационнойподготовкой стало возможным выполнение обширной резекции печени(ОРП).

Смертность после ОРП удалось снизить до 3,2% [11], осложнения,возникающие после выполнения данной операции, остаются на высокомуровне и достигают 47% [65]. Частым осложнением после резекции печениявляетсяпострезекционнаяпеченочнаянедостаточность,котораявозникает в 33,83% случаях и проявляется нарушением синтетическойфункции печени, печеночной энцефалопатией и в ряде случаев можетпривести к смерти [24; 69]. Таким образом, остается актуальнымразработка способов профилактики и лечения данного осложнения впослеоперационном периоде [65].С развитием клеточной медицины стало возможным, в рамкахинициативныхклиническихисследований,применениеклеточныхпродуктов в лечение острой печеночной недостаточности, в частностимультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [148].

Показано,что ММСК способны дифференцироваться в гепатоциты и поддерживатьспецифичные функции гепатоцитов (секреция альбумина, мочевины,накоплениявнутриклеточногогликогена,липопротеиновнизкойплотности) [41; 148; 176; 183]. ММСК способствуют регенерации печенипосредством влияния на противовоспалительную, антиапоптозную ипролиферативную активность [16; 146].Несмотря на изученность ММСК, перед применением ММСК вклиникеприОРП,целесообразнопроведениеисследованиях на адекватных эксприментальных моделях.доклинических80Поданнымнаблюдаетсяразныхавторов,при выполнении >85%вэксперименте,летальностьрезекции печени [164; 178].

Налетальность влиет не только объем операции, но и наркоз, применениеглюкозы в раннем послеоперационном периоде [73; 96]. В зарубежныхработах препарат Золетил не применялся [73; 85; 106]. Учитывая тот факт,что в ранее выполненных работах не изучалось влияние наркоза Золетилана летальность и выживемость исследование проведено на моделях с 70%,85%, 90% резекцией печени.В ходе первого этапа изучали предельно допустимый объемрезекции печени при использовании в качестве наркоза препарат Золетил.После выполнения 70%, 85% резекции печени под в/м наркозом золетила,все крысы прожили 21 сутки (табл. 4).

Следовательно, модели с 70%, 85%резекцией печени при использовании в качестве наркоза Золетила,является не подходящими для оценки летальности и выживаемости, номогут быть использованы для оценки эффективности трансплантацииММСК на разных сроках после операции.При выполнении 90% резекции печени все животные погибли втечение 2 суток (табл. 4). Таким образом, экспериментальная модель срезекцией 90% печени является оптимальной для оценки влиянияклеточного продукта на летальность и продолжительность жизни послеОРП.Вторым этапом изучали влияния трансплантации аллогенных ММСККМналетальность,продолжительностьжизниживотногосиспользованием модели с 90% резекцией печени.При трансплантации 2,5 млн.

аллогенных ММСК КМ в НПВ послерезекции 90% печени статистической разницы в показателях летальности ипродолжительности жизни между 2 исследуемыми группами не было81выявлено (табл. 5).В большинстве работах при трансплантации«классических» ММСК после резекции 90% печени не отмеченостатистически значимых изменений в летальности и продолжительностижизни [73; 85]. Статистически значимые отличия в данных показателяхнаблюдалиприпредварительной«подготовки»данныхклеток(преддифференцировка в гепатоцито-подобные клетки, инкапсулирование,гипоксия клеток) [72; 85; 106; 178].

Таким образом, предварительно не«подготовленные» ММСК не влияют на летальность после резекции 90%печени.В дальнейшем на 2 этапе мы оценили влияние системного введенияаллогенных ММСК КМ на восстановление массы крысы, печени,синтетической функции печени, активность печеночных ферментов,морфологические показатели после 70% резекции печени.В качестве основной модели выбрана модель с 70% резекциейпечени, как наиболее простая, изученная и часто используемая [163].Сроки вывода из эксперимента выбраны на основании изученнойлитературы, учитывая пики синтеза ДНК в клетках печени [102].Масса крысы и печени напрямую отражают восстановлениесинтетическойфункциипечени,статистическаяразницамеждуконтрольной и экспериментальной группой зафиксирована на 4 суткипосле операции (табл.

6, рисунок 11-12). На 4 и 14 сутки отмеченастатистическая разница при анализе альбумина и общего белка (рисунок13А,13Б). На уровень прямого билирубина в крови трансплантацияаллогенных ММСК КМ после ОРП не влияла.Статистически значимая разница в уровне АЧТВ между 2 группамибыла обнаружена на 1 сутки после операции, МНО на 1, 2 и 4 сутки(рисунок 13В,13Г). Улучшение синтетической функции печени после82трансплантации ММСК отмечали зарубежные коллеги в своих работах[179].

Однако, при использовании других моделей им так же удалосьвыявить статистически значимые различия и при анализе уровня общегобилирубина [83]. Работ оценивающих влияние ММСК на показателикоагулограммы при печеночной недостаточности крайне мало, в основномэто единичные клинические случаи применения ММСК, однако и вданных работах отмечено улучшение свертывающей системы крови [72].При анализе полученных данных, затруднительно ответить навопрос, почему в экспериментальной группе с 1 по 4 сутки отмеченоулучшение показателей МНО и АЧТВ (1 сутки), а более высокий уровеньальбумина и общего белка в той же группе выявили на 4 и 14 сутки послерезекции печени.

Если АЧТВ и МНО отражают синтетическую функцию(все факторы свертывания, за исключением фактора VIII синтезируются впечени), то почему синтез альбумина и общего белка происходит на болеепоздние сроки после операции. Возможно, имеются другие механизмывлияния ММСК на свертывающую систему крови.Из полученных данных следует, что трансплантация ММСКспособствует более раннему восстановлению синтетической функциипечени.При анализе печеночных ферментов отмечено более быстроевосстановление ЩФ в экспериментальной группе, приоценки АЛТ и АСТ(рисунок 14А,14Б,14В) не было выявлено статистически значимыхразличий в двух исследуемых группах, в отличие от данных зарубежныхколлег.

Полученные различия можно объяснить использованием другойэкспериментальноймоделиостройпеченочнойнедостаточности(фармакологической, выполнение 2 этапной операции) и сроками выводаиз эксперимента [83; 148; 177]. Кроме того, в литературе имеются случаи,83когда даже при одной химической модели, в одни и те же сроки послеоперации при оценке одного и того же клеточного продукта и показателя(АЛТ и АСТ) отмечены статистически значимые различия на разныесроки.

Однако, как мы уже говорили ранее, во всех исследованияхотмечали улучшения показателей активности печеночных ферментов [148;179].Таким образом, системное введение аллогенных ММСК КМ послерезекции печени способствует раннему восстановлению синтетическойфункции печени (общего белка, альбумина, уровня АЧТВ, МНО)уменьшает активность печеночных ферментов (ЩФ).На третьем этапеизучали влияние трансплантации аллогенныхММСК КМ на пролиферативную, митотическую активность гепатоцитов иморфометрические критерии регенерации паренхимы печени после 70%резекции печени в эксперименте.Прианализеморфометрическихпоказателейневыявленостатистически значимыхотличий в 2 исследуемых группах приопределениичислаколичествамитозов,диаметраядра,площадигепатоцитов и печеночных долек, но выявлены статистические отличияпри анализе количества PCNA позитивных гепатоцитов (рисунок 15-29).Увеличение количество PCNA позитивных клеток отмечали и другиеавторы в своих работах [83].

Анализ диаметра ядра, площади гепатоцита ипеченочной дольки является менее информативным показателем, и болеетрудоемким и зависит от опытности исследователя.Таким образом, системное введение ММСК КМ после резекциипечени способствует пролиферации гепатоцитов (PCNA), но не влияет наколичество митозов, диаметр ядра, площадь гепатоцитов и размерпеченочных долек.84Учитывая безопасность введения аллогенных ММСК КМ (всеживотные выжили при его примненении и резекции 70 – 85% печени),улучшение(нафоневведения)синтетическойфункциипечени,уменьшение активности печеночных ферментов, увеличение количествапролиферации гепатоцитов, данный препарат может быть применен вклинической исследованиях.85Выводы1. Комплексные исследования влияния ММСК на регенерацию печенипосле резекции печени целесообразно проводить используя две модели:- резекция 70% или 85% паренхимы – для изучения функциональных иморфологических изменений;- резекция 90% - для оценки влияния ММСК на летальность ипродолжительность жизни в эксперименте.2.

Трансплантация аллогенных ММСК КМ при выполнении предельнобольших резекций печени не влияет на летальность и продолжительностьжизни в эксперименте.3. Системное введение аллогенных ММСК КМ после обширнойрезекции печени способствует раннему восстановлению функции и массыостатка печени.4.Системное введение аллогенных ММСК КМ при выполнении ОРП вэксперименте увеличивает количество пролиферирующих гепатоцитов(PCNA позитивных клеток), но не влияет на количество митозов, диаметрядра, гепатоцитов, площади печеночной дольки.Практические рекомендацииПрименение аллогенных ММСК КМ после обширных резекцийпечени в клиническо практике позволит уменьшить выраженность ППН засчет раннего восстановления функции, массы печени и влияния данныхклеток на пролиферативную активность гепатоцитов.86СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙАЛТ - аланинаминотрансферазаАЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое времяАСТ - аспартатаминотрансферазаВГБК - вирус геморрагической болезни кроликаГГТ – гаммаглутамилтрансферазаДНК - дезоксирибонуклеиновая кислотаЗФБ - зеленый флуоресцентный белокКМ – костный мозгММСК – мультипотентные мезенхимальные стромальные клеткиМНК - мононуклеарные клеткиМНО - международное нормализованное отношениеНПВ – нижняя полая венаОПН – острая печеночная недостаточностьОРП - обширная резекция печениППН – пострезекционная печеночная недостаточностьРНК - рибонуклеиновая кислотаСК – стволовые клеткиСКК – стволовые кроветворные клеткиТАА - тиоацетамидЧХУ (CCl4)-четыреххлористый углеродЩФ - щелочная фосфатазаЭСК - эмбриональные стволовые клеткиAkt - RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase (альфа серин/треонинпротеин киназа)CDK -Cyclin-dependent kinase (циклинзависимаякиназа)EGF - Epidermal Growth Factor (эпидермальныйфакторроста)87FGF - Fibroblast Growth Factor (факторростафибробластов)GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (коллаген-1,глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа)GSK - glycogensynthasekinase (гликогенсинтазакиназа)HBV – hepatitisBvirus (вирусгепатитаВ)HGF- Hepatocyte Growth Factor (факторростагепатоцитов)IPSCs-InducedPluripotentStemCells(индуцированныеплюрипотентныестволовыеклетки)IL-6 – Interleukine-6 (интерлейкин 6)MELD score - Model For End-Stage Liver Disease (оценка тяжестисостояния пациентов с циррозом печени по шкале)NF-kB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells(ядерныйфакторкаппацепиВклеток)MHV-3-Murinehepatitisvirusstrain3(мышиныйштаммвирусагепатита 3)p-AMPK–phospho-5′-Adenosine-monophosphate-activatedproteinkinase (фосфоаденозинмонофосфатпротеинкиназа)PBS - phosphate buffered saline (фосфатно-солевойбуферныйраствор)PCNA-ProliferatingCellNuclearAntigen(ядерныйантигенпролиферирующихклеток)STAT 3 -Signal Transducer and Activator of Transcription 3(трансдукторсигналаиактиватортранскрипции 3)SDF-1a-Stromalcell-derivedfactors1-alpha(стромальныйклеточныйфакторальфа 1)SOCS-suppressorcytokine(супрессорыпередачисигналовцитокинов)signaling88SOCS1-suppressorcytokinesignaling1(супрессорыпередачисигналовцитокинов 1)TGF-α-TransformingGrowthFactor-αGrowthFactor-β(трансформирующийфакторроста-α)TGF-β-Transforming(трансформирующийфакторроста-β)TNF-α - Tumor Necrosis Factor-α (факторнекрозаопухолей-α)VEGF -Vascularendothelialgrowthfactor (сосудистыйфакторроста)89Список литературы1.Газизов И.М.