Диссертация (Связь структурных и фотофизических параметров координационных соединений лантаноидов и актиноидов), страница 9

Для этоготребуется поиск альтернативных лигандов. В рамках данной работы исследовалиськомплексы бензо-диаза-краун дикарбоновой кислоты H2L и Eu3+ как представителялантаноидовметодамистационарнойивремя-разрешённойлазернойфлуоресцентной спектроскопии. Результаты наших экспериментов сопоставлялись срезультатамиэкспериментовпоспектроскопиирентгеновскогопоглощения(EXAFS) и квантово-химического моделирования.Структурно выбранный лиганд H2L отличает то, что в нем присутствуетменьшее количество COOH групп (см.

Рис. 11), удерживающих катион в областицентра гетероцикла, чем в DOTA, что, как ожидалось, приведет к уменьшениювремени образования комплекса с одновременным уменьшением константыкомплексообразования.Рис 11. Структура исследуемого лиганда H2L583.2.1 Материалы и образцыДляопределенияконстантыкомплексообразованияихарактеризациикоординации комплекса металла РЗ с выбранным лигандом были приготовлен рядрастворов с постоянными значениями концентрации европия 5 10-5 М, pH 6, ионнойсилы 0.1 М и отличающимися концентрациями лигнада H2L в диапазоне 10-5 – 10-3М, а также раствор без лиганда.3.2.2 Стационарная флуориметрияФлуоресценция указанные образцов измерялась с использованием ламповогофлуориметра при длине волны возбуждающего излучения 394 нм и значенияхширины спектральных щелей систем возбуждения и регистрации, равных 5 нм, сшагом 1 нм и накоплением сигнала в каждой точке 0.1 с.Поскольку лиганд обладает собственной люминесценцией, для работы соспектрами люминесценции европия, из измеренный спектров с помощьюинтерполяции вычиталась люминесценция лиганда.

В результате были полученыспектры люминесценции европия, представленные на рис. 12.Рис. 12. Спектры люминесценции растворов комплексов европия с лигандомH2L59Видно, что в соответствии с литературными данными, можно выделить дваинтенсивных пика, соответствующих переходам 5D0 - 7F1 (590 нм), 5D0 - 7F2 (615 нм).Действительно,интенсивностьлинии,соответствующейвторомупереходу,существенно меняется при изменении концентрации лиганда, то есть приобразовании комплекса. Для построения зависимости интенсивности пиков отконцентрации, мы аппроксимировали данные спектры суммой двух гауссовыхпиков. В результате были получены следующие кривые.Зависимость амплитуды пика A2 от концентрации лиганда является суммойзависимостей амплитуд пика свободного европия и связанной формы, каждая изкоторых является произведением доли данной формы и амплитуды пика в случае,если данная форма - единственная в растворе:где– интенсивность второго пика для раствора чистого европия врастворе с выбранной концентрацией европия,– интенсивность второго пикакомплекса европия в растворе, в котором весь европий находится в комплексе,-доля свободного катиона европия в растворе.Для определения константы комплексообразования методом наименьшихквадратовпроизводиласьнаблюдаемыхвминимизацияэкспериментекомплексообразованияKдля , следующего из решения системыневязкизначений,исмодельнойзависящейучетомзависимостиотиконстантывыражения60Такимобразом,былополученозначенияконстантыэкстракции,соответствующее величине log K = 7.1 ± 0.1Результат проведенной аппроксимации приведен на рисунке 13.Рис.13.

Экспериментальная зависимость интенсивности второго пика взависимости от концентрации лиганда в образце и ее аппроксимацияДляопределениядополнительносодержалосьпоставлен500мклмасштабаскоростиследующийраствораобразованияэксперимент:европиявкомплексакювету,добавлялсявмалыйбылкоторойобъемконцентрированного раствора лиганда таким образом, чтобы итоговая концентрациялигандасоответствоваламаксимальнойвописанномвышеэксперименте,61одновременно начинались повторяющиеся измерения спектров люминесценциираствора с периодом повторения в несколько секунд.Результатом данного эксперимента является значение времени связывания прикомнатной температуре, по порядку равное значению периода измерения - меньшеили порядка 10 секунд. Таким образом, данный лиганд действительно образуеткомплексы за время существенно меньшее, чем для лигандов DOTA и егопроизводных.3.2.3 Кинетическая флуориметрияДля определения дополнительной структурной характеристики – количествамолекул воды в первой координационой сфере комплекса – нами были проведеныэксперименты по наблюдению кинетик люминесценции тех же растворов.

Отметим,что в этих экспериментах для возбуждения люминесценции использовалосьизлучение третей гармоники Nd:YAG лазера с длиной волны 355 нм. Известно, чтопри данной длине волны возбуждения европий не обладает собственнойлюминесценцией, однако в нашем эксперименте наблюдалась ярко выраженнаялюминесценция комплекса.

Было предположено, что она возбуждается за счетпоглощения излучения лигандом комплекса и переносом энергии возбуждения наион металла в комплексе. Для подтверждения данных соображений, нами былаизмереныспектрыстационарнойлюминесценциирастворовснулевойимаксимальной концентрацией лиганда при различных длинах волн возбуждения.

Изкаждогоспектракомплексавычиталасьинтерполированнаяинтенсивностьлюминесценции лиганда, после чего были построены графики зависимостиинтенсивность пика 5D0 - 7F2 от длины волны, которые приведены на рисунке 14.62Рис.14. Спектры возбуждения европия в водном растворе (черная кривая) икомплекса (в диапазоне 350 – 400 нм)Видно, что комплекс обладает большей люминесценцией при длине волнывозбуждения 394 нм за счет уменьшения переноса энергии возбуждения на воду иширокимкрылом вУФ,аналогичнымспектру возбуждениясобственнойлюминесценции лиганда.Таким образом, в спектрах, регистрируемых на установке с лазернымвозбуждением, проявляется только люминесценция комплекса.

Для измерениякинетик из ранее приготовленной серии были выбран образец с максимальнойконцентрацией комплекса. Измеренные кинетики затухания люминесценцииприведены на рисунке.63Рис.15. Графический результат аппроксимации кинетики люминесценции раствора скомплексом европия и H2L биэкспоненциальной зависимостьюПолученная кинетика отличается от экспоненциальной, что наблюдалось вэкспериментах других групп и может быть объяснено наличием двух форм илипроцессом с переносом заряда.Из-за отсутствия точной модели, описывающий данный процесс дляопределениявременижизнивозбужденногосостояния,мыпроводилиаппроксимацию измеренных кинетик суммой двух экспонент, а для определенияколичества молекул воды в первой координационной сфере выбирали большеезначение, соответствующее хвосту кинетики. Таким образом, были полученывремена, соответствующие показателям экспонент, τ1 = 64 ± 20 мкс и τ2 = 423 ± 15мкси значение числа молекул воды в первой координационной сфере, равноеn = 2.0 ± 0.4, что свидетельствует о частичной экранировке иона металла в комплексеот молекул воды раствора.643.2.4 Обсуждение результатовДля лиганда, возможность применения которого в радиофармпрепаратахисследовалась впервые, были получено значения константы комплексообразования.Была определена стехиометрия комплекса, то есть количество ионов европия,связанногокаждымлигандом.Данноезначениеравноединице,ибылоподтверждено параллельно проведенным исследованием методом радиометрии.Полученное значение логарифма константы комплексообразования log K = 7.1± 0.1 близко к значению log K = 7,6±0,2, параллельно полученному методомрадиометрии нашими коллегами с кафедры радиохимии химического факультетаМГУ.Следует отметить, что значение логарифма константы комплексообразованиявесьма низко по сравнению со стандартным лигандом DOTA, а именно меньше на15-20 порядков, что, естественно, делает лиганд H2L не таким привлекательным дляпрактического использования.

С другой стороны, как и ожидалось, данноеуменьшение константы комплексообразования, по-видимому, обусловленное ростомскорости распада комплекса, происходит вместе с (менее существенным) ростомскорости образования комплекса из свободного катиона метала и молекулы лиганда.При этом время образования комплекса с H2L составляет значения менее 10 с посравнению с десятками минут при повышенной температуре для DOTA. Отметим,что с практической точки зрения, нет существенной разницы между временамисвязывания, равными 10 с и 0.1 с, что обусловлено другими лимитирующимистадиями фармакологического действия радиоактивного препарата, а именно егоподготовкой (смешиванием) и доставкой в организме.

Таким образом, данныйлиганд можно охарактеризовать как быстрый.Из структуры комплекса, полученной нашими коллегами методом квантовомеханического моделирования, следует, что в комплексе он может предоставить65максимум7донорныхкоординационноисфереатомовкатионадлясвязывания.европиявОставшиесяаналогичныхместавсистемахсполиазаполикарбоксилатами традиционно заняты молекулами воды. Катион Eu 3+характеризуется координационным числом 9, ввиду чего логичным представляетсяналичие именно 2 молекул воды в его окружении, что согласуется с результатамибиэкспоненциальнои аппроксимации.3.3 Исследования процесса комплексообразования РЗ с белком плазмы кровиКак было сказано в обзоре литературы, помимо методов определенияструктуры комплекса по люминесцентным параметрам металла, существуютспособы характеризации процесса комплексообразования по люминесцентнымсвойствам лиганда. Из литературы известно, что результаты, получаемые из кривыхтушения флуоресценции лигандовв логарифмическом масштабе – а именно,значение числа сайтов на одну белковую молекулу n = 1 - отличаются от значений,полученных из флуоресценции европия и общих представлений о связывании ионовметалла белком.