Диссертация (Связь структурных и фотофизических параметров координационных соединений лантаноидов и актиноидов), страница 10

Как было указано в обзоре литературы, наблюдаемая картинатипична для экспериментов, в которых характеристики связывания определяютсяметодом тушения собственной флуоресценции белка.Длятогочтобыболееполнорассмотретьпричинынеадекватностилогарифмического выражения Штерна-Фольмера для определения числа сайтовсвязывания, в мы рассмотрели связь между процессом комплексообразования икривымитушенияфлуоресценциииз«первыхпринципов».Имеямоделькомплексообразования, можно получить зависимости концентрации комплексовбелок-металл от концентрации лиганда, а затем, используя набор значенийквантового выхода флуоресценции, рассчитать кривые тушения и определить ихнаклон в логарифмическом масштабе. Ниже мы приведем результаты такого66моделирования для случая независимых сайтов и ступенчатого присоединениялигандов и их анализ.3.3.1 Модели комплексообразования: независимые сайты и ступенчатоеприсоединение лигандов.ВметодеШтерна-Фольмераобычно(МШФ)рассматриваетсяпоследовательное присоединение лигандов, описываемое следующим уравнением:Вторая модель, которая описывает процесс комплексообразования, принимаетвсе сайты независимыми, а вероятность присоединения лигандов к ним-равновероятной.

Таким образом, в реакции комплексообразования рассматриваютсяне отдельные молекулы белка P, а сайты S, концентрация которых в растворе выше,чем концентрация белка в число раз, равное количеству сайтов, приходящихся наодин белок. Уравнение реакции в данном случае может быть записано следующимобразомИменно модель независимых сайтов лежит в основе метода Скэтчарда, а такжеиспользуется для критики МШФ [65].

Данная модель более адекватно описываетсвязывание белков и металлов, поэтому ниже будет рассмотрена именно эта модель.3.3.2 Распределение комплексов белок-лигандДлятого,чтобыпоказатьпричины,покоторымаппроксимациямодифицированным уравнением Штерна-Фольмера приводит к одинаковомузначению n, не согласующемуся со значениями, полученными другими методами,мырассмотримусловияприменимостиисамосогласованноститакойаппроксимации более подробно. Основной акцент будет сделан на анализевыражения (1) (см. п. 1.2.4).67Равновесные концентрации белка, металла и комплекса определяютсязначениями полных концентраций компонент в растворе и значением константыкомплексообразования в соответствии со следующим выражением:Для того, чтобы получить значения концентраций компонент комплексовбелка с различным числом связанных металлов, в силу независимости сайтов белкаможно воспользоваться соотношением для вероятности группировки k занятыхсайтов в одной молекуле c n сайтами:(9)где [P]T - полная концентрация белка в растворе, p – вероятность того, что сайтбелка занят металлом:(10)Ясно, что в растворе не могут одновременно доминировать компонентыбелковых комплексов, в которых число занятых сайтов велико и мало.

Данный факттакже может быть продемонстрирован графически c помощью численногомоделирования. Для этого был проведен расчет распределения комплексов взависимости от полной концентрации металла в растворе при значениях параметровn = 5 и log K = 4. Результаты расчета приведены на рисунке 1668Рис. 16. Распределение комплексов в модели раствора белка с европием приn = 5, log K = 4; [P]T = 1·10-5 M.Как видно, в диапазоне [Q] >> K-1 белок,несвязанныйсметаллом,практически отсутствует.3.3.3 Анализ вида кривых тушения люминесценцииРассмотрим, какой вид будут иметь зависимости, исследование которыхпроводится при использовании модифицированного уравнения Штерна-Фольмера, вразных диапазонах концентраций для различных моделей связывания и измененияквантового выхода люминесценции при комплексообразовании.Статическое тушениеНапомним, что под статическим тушением подразумевается случай, в которомпри образовании комплекса белка с металлом, белок перестает люминесцировать.Тогда в случае статического тушения, для интенсивности люминесценциибелка F имеет место соотношение69В случае малой концентрации металла, такой что K[Q]1, из уравнения (10)следуетp ≃ K[Q]Тогда из уравнения (9) для значения концентрации свободного белка (то есть вслучае k = 0), можно получить≃[Подставляя данное выражение в выражение, определяющее логарифмическуюкривую Штерна-Фольмера (1), раскладывая дробь под логарифмом по степеням p иудерживая только члены первого порядка, получаем соотношение≃Таким образом, в данном случае коэффициент пропорциональности междуравен единице и не зависит от числа сайтов, приходящихся наодну белковую молекулуВ случае большой концентрации металла-тушителя (K[Q] ≫ 1) значениевероятности заселенности отдельного сайта велико и близко к единице, изуравнения (10) можно получить≃Таким образом, из выражения (9) получаем≃,70а для логарифма, входящего в модифицированное выражение ШтернаФольмера,≃Данноевыражениеаналогичноклассическомувыражениюдлялогарифмического выражения Штерна-Фольмера.

В реальных экспериментахданный случай обыкновенно не реализуется, по-видимому, из-за малой пригодностипредположения о статическом тушении, при котором в случае большойконцентрации тушителя и большой доли связанных сайтов, должно наблюдатьсяуменьшение интенсивности люминесценции на несколько порядков, при том чтонаблюдаемые значения изменения интенсивности люминесценции составляют, какправило, величину около десятков процентов.Рис. 17: Логарифмические кривые Штерна-Фольмера, полученные для моделибелка, состоящего из n независимых сайтов связывания для случая статическоготушения при значениях параметров n = 1, 3, 5, 7 и log K = 4.71В качестве иллюстрации описанных выше наблюдений приведем графиклогарифмических кривых Штерна-Фольмера, полученныхчисленным расчетомтушения люминесценции для приведенных моделей и значений параметров n = 1, 3,5, 7 и log K = 4. Результаты аппроксимации кривых в областях низких (менее 10-5 М)и высоких концентраций (более 10-3 М) приведены в таблице 2.Таблица 2.

Значения тангенсов угла наклона кривых, полученных в результатерасчета модели белка с различным числом независимых сайтов связывания n, случаястатического тушения люминесценции белка при комплексообразовании вдиапазоне низких (nlow) и высоких (nhigh) концентраций.nnlownhigh1 1.0028 ± 0.0025 1.003 ± 0.00331.03 ± 0.032.92 ± 0.0751.06 ± 0.054.90 ± 0.0971.07 ± 0.076.91 ± 0.10Графики и результаты аппроксимации кривых, выбранных в качествепримера, подтверждают описанные выше закономерности. В области малыхконцентраций коэффициент наклона кривых не зависит от числа сайтов и равенединице, в случае больших концентраций значение коэффициента наклона кривыхравно числу сайтов связывания, при этом логарифм величины, характеризующейстепень тушения люминесценции, составляет величину больше или порядкаединицы.Динамическое тушениеПод динамическим тушением мы будем понимать образование комплекса, укоторого сохраняется остаточная люминесценция.

В случае динамического тушения,72в люминесцентный отклик раствора, состоящего из смеси свободного белка икомплексов белка с металлом, дают вклад все компоненты раствора, интенсивностьявляется суммой интенсивностей каждого компонента. Таким образом,Рассмотрим зависимости, получающиеся для логарифмического показателятушения интенсивности люминесценции белка для малых и больших концентраций.Малые концентрации металлаКак и в случае статического тушения, имеет место соотношение[≃,[≃Таким образом, для интенсивности флуоресценции в отсутствие тушителя и придобавлении тушителя имеют место соотношения.Процедурой, аналогичной описанной выше, можно получить:Таким образом, для данной модели тушения и модели независимых сайтов вкачестве модели комплексообразования наклон зависимости логарифма тушения отконцентрации тушителя не зависит от числа сайтов.Высокие концентрации тушителяВ этом случае73Таким образом, концентрация комплексов с большим числом занятых сайтовоказывается много большей, чем концентрация белков, у которых занято меньшеечисло сайтов [PQk] ≫ [PQk−1], поскольку преимущественно все сайты в данномслучае оказываются связанными.

Если квантовый выход комплексов белка с любымколичеством присоединившихся металлов не равен нулюдля.Таким образом, интенсивность люминесценции раствора в данном случаеасимптотически (как гипербола) выходит на некоторый постоянный уровень,аналогично будет вести себя и зависимость.В качестве примера приведем графики зависимостей, полученные в результатерасчета данной модели для случая, аналогичного рассмотренному в предыдущемпараграфе.

Выберем несколько значений числа сайтов, приходящихся на однумолекулу белка: n = 1, 3, 5, 7, логарифм константы комплексообразования металла ссайтом белка log K = 4. В качестве модели изменения квантового выхода приобразовании комплексов рассмотрим следующую: будем считать, что квантовыйвыход чистого белкаравен единице, а квантовый выход при присоединенииодного металла уменьшается на 0.05. Результаты расчета приведены на рисунке 1774Рис. 18: Логарифмический график Штерна-Фольмера для модели белка снезависимыми сайтами с числом сайтов n = 1, 3, 5, 7, логарифмом константыкомплексообразования log K = 4 для случая динамического тушения, где квантовыйвыход комплекса с k металлами равен 1 – 0.05kВидно, что поведение графика соответствует описанному аналитически:тангенс угла наклон при малых концентрациях равен единице и не зависит от числасайтов, при больших концентрациях вне зависимости от количества сайтов,приходящихся на одну белковую молекулу, модифицированные зависимостиШтерна-Фольмера выходят на плато.Предложенное описание показывает, что модифицированное выражениеШтерна-Фольмера, описывающее зависимость интенсивности люминесценциилиганда от концентрации добавленного металла в экспериментах по наблюдениютушения люминесценции лиганда может быть использовано для определениястехиометрии образующегося комплекса лишь в одном случае, а именно, если приобразованиикомплексапроисходитстатическоетушениелюминесценции75органической молекулы.

Это обычно не наблюдается на практике: в данном случаеинтенсивность люминесценции должна резко падать на несколько порядков сдобавлением необходимой концентрации тушителя, при этом типичное изменениеинтенсивности люминесценции органического лиганда в экспериментах составляетнесколько десятков процентов.3.4 Исследование фотофизики РЗ в комплексах, образующихся в процессеэкстракцииЗапишем уравнение реакции, протекающей в процессе жидкостной экстракцииводного раствора тербия лигандом HL, растворенным в органической фазе:,где- количество молекул лиганда, с которыми связывается тербий впроцессе экстракции, определяющее координацию тербия.Используяданноеуравнениехимическойвыражение, позволяющее определять значениеВведем константу разделенияреакции,можнополучитьиз экспериментальных данных., которая определяется отношением концентрацийтербия в органической и водной фазах:Выразим константу экстракции через константу разделения:Далее возьмем логарифм от обеих частей и найдем зависимость коэффициентаот pH и концентрации лиганда:76(11)Отсюда получим, что логарифмзависит линейно от pH и логарифмаконцентрации лиганда.