Структурообразование в объеме гидрогеля, индуцированное взаимодействием с низкомолекулярными амфифильными соединениями, страница 2

Во всем исследованном диапазоне pH коэффициентраспределенияфенилаланина(отношениемолярныхконцентрацийфенилаланина в геле и в растворе) k > 1(рис. 1). Следовательно, сродствофенилаланина к гелю наблюдается как в кислой, так и щелочной средах. Этоуказывает на наличие специфических взаимодействий молекул фенилаланинасо звеньями каррагинана. При этом в кислой среде абсорбция фенилаланинавыше, чем в нейтральной и щелочной средах.

Этот эффект можно объяснитьналичием электростатического притяжения между положительно заряженнымимолекулами фенилаланина (протонированными в кислой среде) и отрицательнозаряженными звеньями каррагинана.Методом ДСК были определены основные термодинамические параметрыконформационного перехода спираль-клубок («плавление» геля) в геляхкаррагинана в присутствии фенилаланина при различных рН: температураконформационного перехода Tt (температура середины перехода), энтальпияперехода ΔtH (площадь под графиком зависимости избыточной теплоемкостиот температуры), ширина перехода Δt T (ширина пика на термограмме наполувысоте). Анализ численных значений параметров перехода показываеттабл.

1. Видно, что фенилаланин не влияет на параметры конформационногоперехода во всем исследованном диапазоне pH. Следовательно, отсутствуетвлияние фенилаланина на спиралеобразование молекул κ-каррагинана. Этопредположениеподтвердилииисследованиясетокадсобированных на поверхности, выполненные методом АСМ.6каррагинана,5k43212468pHTt, 0CΔt H,Дж/гΔt T, 0C2.044.0353.62.545.2343.93.046.1343.93.545.7363.84.046.7363.86.345.7353.8СредниезначенияБез фенилананинарН 6.510pHРис.1Зависимостькоэффициентараспределения фенилаланина от рНвнешнего раствора.45.5 ± 1.4 35 ± 1 3.8 ± 0.245.0373.7Таблица1.Термодинамическиепараметры перехода спираль-клубокκ-каррагинанавприсутствиифенилаланина 48 мМ.Исследование взаимодействия κ-каррагинана с лизином выполненометодом ДСК.

Изоэлектрическая точка лизина pI равна 10.54. Исследованиебыло проведено при pH 6.5, то есть в условиях, когда κ-каррагинан заряженотрицательно, а лизин (лиганд) – положительно.При всех исследуемых концентрациях лизина и κ-каррагинана натермограммах наблюдается ассиметричный пик избыточной теплоемкости (рис.2), характерный для конформационного перехода двойная спираль-клубок.

Сувеличением концентрации лизина наблюдается смещение пика теплоемкости,связанного с конформационным переходом, в область более высокихтемператур.7L=0L=12 мМL=47 мМL=137 мМL=186 мМΔcp, Дж/г/K8Рис. 2 Термограммы κкаррагинанаприразличныхконцентрациях лизина(L). Cкарр = 0.5 мг/мл,СKCl = 30 мМ. Скоростьсканирования1 К / мин.6420304050600T, CАнализ взаимодействия κ-каррагинана с лизином проводили с помощьюмодели связывания лигандов на независимых идентичных центрах (модельЛенгмюра).

В рамках этой модели :ΔtgЕ(T0) = Δbgh- ΔbgcΔbgc = - ncRTln(1 + KcL)Δbgh = - nhRTln(1 + KhL)где ΔtgЕ(T0) – избыточная свободная энергия при температуре переходасвободного полисахарида (L=0), Δbgc и Δbgh – свободные энергии связываниялиганда с клубковой и спиральной конформациями; Kс и Kh – константысвязывания лиганда с клубковой и спиральной конформациями, nc и nh – числоцентров связывания, приходящихся на удвоенный моль повторяющихся единицполисахарида в клубковой и спиральной конформации, соответственно.Путемаппроксимацииэкспериментальныхданныхтеоретическойзависимостью, избыточной свободной энергии перехода двойная спираль –клубок κ-каррагинана от концентрации лизина , были вычислены константы8связывания Kс и Kh.

В случае лизина Kс = (0.8 ± 0.5) л/моль и Kh = (1.9 ± 0.6)л/моль.Отношение Kh / Kс для лизина равно 2.46, что указывает напредпочтительное связывание лизина со спиральной конформацией κкаррагинана.Аналогичные измерения были проведены для связывания ионов Li+ вкачестве системы сравнения (взаимодействия только электростатические.) Вслучае LiCl Kс = (0.56 ± 0.18) л/моль и Kh = (1.06 ± 0.21) л/мольОтношениепредпочтительноеKh/KссвязываниедляLiClLiClсоравно1.89,спиральнойчтоуказываетнаконформациейκ-каррагинана.Величины констант связывания Кс для лизина и ионов лития сопоставимы,что отражает неспецифический (в основном, электростатический) характерсвязывания обоих лигандов клубковой формой κ-каррагинана.

В то же время,константа связывания Kh для лизина заметно больше константы связывания Khдля ионов лития. Это различие отражает вклад неэлектростатических факторовв энергетику связывания лизина спиральной формой κ-каррагинана. К такимфакторам, в частности, можно отнести частичное обобществление протона приобразовании ионной пары между сульфатной группой полисахарида ипротонированной аминогруппой лизина.Взаимодействие κ-каррагинана с катионным ПАВ цетилтриметиламмонийбромидом(ЦТАБ).Связывание молекул катионного ПАВ (ЦТАБ) и индуцированноеданным взаимодействием структурирование геля κ-каррагинана исследовалосьметодами ДСК, АСМ и МУРР.Были определены термодинамические параметры перехода двойнаяспираль - клубок κ-каррагинана в зависимости от концентрации ПАВ.9На рис. 3 показаны термограммы второго сканирования κ-каррагинана,полученные при различных концентрациях ПАВ.

Можно заметить, что приконцентрацях ЦТАБ выше 0.4 мМ термограмма становится бимодальной,причем с ростом концентрации ПАВ происходит уменьшение площади первогопика и увеличение площади второго. Тот факт, что температуры первого ивторого переходов изменяются незначительно при изменении концентрацииПАВ, и температура первого пика совпадает с температурой пика свободного(“нативного”) полисахарида, позволяет сделать вывод о наличии в каррагинанедвух типов последовательностей остатков, характеризующимися разнымитемпературами плавления: “нативная” и лигандированная.8L=0.7 мМL=0.5 мМL=0.3 мМL=0Δcp, Дж/г/KΔcp, Дж/г/K6Cкарр=1 мг/мл, L=1.4 мМ242Cкарр=0.5 мг/мл, L=0.6 мМCкарр=0.5 мг/мл, L=01001530456075904060800T, C0T, CРис.

3 Термограммы κ-каррагинана приразличных концентрацях ЦТАБ(L).Cкарр = 0.5 мг/мл, СKCl = 30 мМ. Скоростьсканирования 1 К / мин.Рис. 4 Термограммы первогосканирования растворовкаррагинана и ЦТАБ без KCl.На рис. 4 показаны термограммы κ- каррагинана и ЦТАБ при различныхконцентрациях полисахарида и ПАВ в отсутствии фонового электролита (KCl).Наличие пика избыточной теплоемкости c температурой максимума, независящей от концентрации κ-каррагинана и ЦТАБ на термограмме показывает,что конформационный переход наблюдается и в отсутствии K+, индуцирующихобразование спиралей.

Причем температура этого перехода (~ 71 С0)10значительно выше, чем температура перехода свободного полисахарида вприсутствииKCl.Наблюдаемыйконформационныйпереходотражает«плавление» упорядоченных агрегатов каррагинан-ЦТАБ.На рис. 5 представлен АСМ-скан локальных сеток к-каррагинана,полученных из 0.05 % раствора κ - каррагинана и 0.01 М KCl. На АСМ-сканахвидны сетки, образованные самопересекающимия волокнами из молекулкаррагинана. Высота волокон составляет от 0.3 до 1 нм, что указывает наналичие как неспиральных (0.3-0.5 нм), так и спиральных молекул схарактерной высотой 1-1.2 нм.

Добавление ЦТАБ приводит к изменениюструктуры сеток (Рис. 6). Сравнительный анализ сеток показывает, чтоколичество сшивок увеличилось, спирали объединились в более толстые тяжи свысотой до 3 нм, характерной для агрегатов спиралей. Также на поверхностинаблюдается образование мицелл ЦТАБ: размер отдельных мицелл 3-3.5 нм. Изполученных результатов следует, что для исследуемых систем наблюдаетсясосуществование отдельных мицелл ПАВ и их агрегатов с высотой до 8-10 нм.С целью выяснения влияния сетки каррагинана на размер мицелл ЦТАБ былипроведено сравнительное АСМ исследование мицеллообразования ЦТАБ наповерхности слюды в присутствии и отсутствии полисахарида.

Размер мицеллПАВ, адсорбированных из солевого раствора KCl в отсутствии полимерасоставляет 3-3.5 нм, что совпадает с величиной мицелл в присутствииполимера. Однако, агрегации мицелл без полисахарида не обнаружено.В отсутствии ионов K+ так же наблюдалось структурообразование молекулполисахарида и ЦТАБ (рис. 7). Однако, тяжи стали более толстыми икороткими.

Высота тяжей составляет от 0.9 до 3 нм, что указывает на наличиеагрегатов каррагинан-ПАВ со структурой, отличной от двойных спиралейкаррагинана, сформированных в присутствии KCl (рис. 5). На поверхноститакже присутствуют мицеллы ЦТАБ с характерной высотой 3-3.5 нм.11Рис.5Локальныесеткиккаррагинана, адсорбированные наповерхности слюды. Скарр = 0.05%,СKCl = 0.01М.Рис. 6 Локальные сетки ккаррагинана, адсорбированные наповерхности слюды в присутствииЦТАБ. Скарр = 0.05%, СKCl = 0.01М,СЦТАБ = 0.15 мМ.Рис. 7 Локальные сетки ккаррагинана, адсорбированные наповерхности слюды в присутствииЦТАБ в бессолевом растворе. Скарр= 0.05%, СKCl = 0, СЦТАБ = 0.15 мМ.12Исследование структуры агрегатов каррагинан – ЦТАБ проводилосьметодоммалоугловогорассеяниярентгеновскихлучей(МУРР).Гелькаррагинана не дает характеристических Брегговских пиков на кривоймалоуглового рассеяния (Рис. 8, кривая 1). Слабый Брегговский пик появляетсяна кривой рассеяния геля каррагинана, сформированного в присутствии ЦТАБи KCl (Рис.