Автореферат (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 3

Буквамиотмечены локальные энергетические минимумы.Полученные параметры были использованы для создания моделей ЛПСмолекул (разд.4)и ЛПС-содержащих систем (мицелл и мембран). Былирассмотрены модели мицелл, состоящих изгдеNмолекул Re-, Ra- и S-LPS,N = 4, 6, 8, 14 (рис. 6 A), и для уравновешенных в растворе структурбыла оценена площадь гидрофобной поверхности липида А, экспонированной в раствор (разд.5).Эта величина убывает с увеличением числамолекул, входящих в состав мицеллы, а также снижается с увеличениемуглеводной составляющей молекул ЛПС (рис.

6 B). Тем не менее, для всех15полученных агрегатов ее величина достаточно велика, что свидетельствует о склонности ЛПС к формированию агрегатов, содержащих большееколичество молекул, чем может быть исследовано в рамках МД моделирования. При этом, взаимодействующие друг с другом цепочки О-антигенасущественным образом влияют на структуру гидрофобной части мицелл.Рис. 5: Значения площади на липид в расчетах для модельных бислоев.Зеленым отмечена область, соответствующая экспериментальным данным.В разд.6четвертой главы представлены результаты МД расчетов длядвух моделей наружной мембраны грам-отрицательных бактерий. Перваямодель представляла собой чистый ЛПС бислой, один из монослоев которого состоял из Ra-LPS, в то время как половина молекул второго монослоя несла на себе О-антиген. Вторая модель представляла собой бислойRa-LPS/S-LPS, пронизанный мембраннымиβ -бочонкамимолекул белкаOmpA.

В качестве стартовой конформации О-антигенных цепей в каждой модели была выбрана энергетически выгодная спиральная структура,построенная на основе анализа подвижности свободного О-антигена в растворе, а также полученных для дисахаридных фрагментов распределенийсвободной энергии по конформациям (рис. 4). Локальная конформационная подвижность О-антигенных цепей хорошо соответствует результатам,16полученным для свободных О-антигенов. Для О-антигеновS. typhimuriumв мембранном окружении характерно образование шпилек за счет перехода О-гликозидной связи между остатками маннозы и ранозы, как это имело место для дисахаридов и свободных цепей.

Тем не менее, глобальнаяархитектура О-антигенного слоя существенно зависти от выбора модели.Рис. 6: Структура (А) и площадь экспонированной в раствор гидрофобнойповерхности (В) ЛПС-мицелл в МД расчетах.Равномерно распределенные цепи в чистой ЛПС-мембране взаимодействуют попарно и слипаются друг с другом, сохраняя относительно вытянутую конформацию. Результирующий слой О-антигенов на поверхностимембраны имеет относительно однородную структуру (рис. 7 A) и высокую плотность. Наличие молекул белков в ЛПС-бислое ведет к образованию неравномерно распределенных полостей между несущими О-антигенмолекулами ЛПС. О-антигены в этой модели активно взаимодействуютдруг с другом, образуют множественные шпильки за счет переходов в Огликозидных связях и изменениях в конформациях колец, запутываясьдруг с другом.

В результате таких сложных взаимодействий, О-антигеныукладываются на поверхности мембраны, образуя крайне гетерогенную17структуру. В частности, над молекулами белков образуются водные полости размером порядка 1 нм3, разделенные областями пространства, занятыми плотно переплетенными цепочками О-антигена.Рис. 7: Финальная структура модели бактериальной мембраны RaLPS/Ra-LPS & О12-LPS (А) и мембраны Ra-LPS/O12-LPS/OmpA после500 нс уравновешивающих МД расчетов.В последнем разделе четвертой главы получены предварительные результаты по моделированию бислоев ЛПС с модифицированным липидом А. Проведено сравнение ApL для ЛПС, содержащих в составе липида А один, два или ни одного остатка 4-амино-L-арабинозы (Ara4N).Этот положительно заряженный остаток снижает общий отрицательныйзаряд молекулы ЛПС (что повышает устойчивость бактерий), а также потенциально способен влиять на плотность упаковки молекул в бислое, таккак располагается по бокам от остатков глюкозы в составе липида А.

Внашей модели добавление остатков двух остатков Ara4N увеличивает ApLв ∼ 1.2 раза по сравнению с немодифицированным ЛПС-бислоем. Наблюдаемое увеличение площади при добавлении Ara4N не было обнаруженоранее [22] из-за различий в количестве ацильных цепей в составе рассмат18риваемых ЛПС. Тем не менее, изменение ApL оказывает влияние на плотность упаковки О-антигенов, а значит, может существенное влиять на ихконформационную подвижность в случае использования модифицированных молекул для моделирования мембран гладких штаммов.Взаключении сформулированы основные результаты и выводы дис-сертационной работы. Вприложении приведены численные схемы и зна-чения параметров, использованные для интегрирования моделей из третьей главы.Основные результаты и выводы1.

В реакционно-диффузионной модели основных реакций каскада свертывания были получены аналитические условия существования автоволновых решений, а также решений стационарной системы типапульс, определяющих достаточное условие начала распространенияавтоволны концентрации тромбина в ответ на возмущение системы.Таким образом, критическая для начала роста тромба концентрациятромбина, образованная в ответ на активацию внешнего или внутреннего пути, может быть оценена как решение типа пульс для моделиосновных реакций каскада свертывания.2. Получены аналитические оценки скорости распространения автоволновых решений реакционно-диффузионной модели основных реакций каскада свертывания. Таким образом, скорость роста тромба врассматриваемой модели может быть приближенно вычислена череззначения параметров системы до проведения модельных расчетов.3.

В численном эксперименте для упрощенной модели образования тромба в венуле диаметром50 мкмоценен критический размер зоны по-19вреждения на стенке сосуда (∼ 50–90 мкм), ведущий к закупорке сосуда при запуске внешнего пути каскада свертывания крови. Повреждения такого размера при сепсисе может соответствовать откреплению одного эндотелиоцита в результате взаимодействия с ЛПС.4. Разработана кинетическая модель активации контактного пути ЛПСагрегатами, воспроизводящая доступные экспериментальные данные. Показано, что немонотонная зависимость степени актива-in vitroции контактной системы от концентрации ЛПС (максимальная активность при концентрации ЛПС ∼ 20 мкМ) обусловлена агрегатным состоянием ЛПС в растворе.

Таким образом, надмолекулярнаяструктура ЛПС должна оказывать существенное влияние на активацию внутреннего пути каскада свертывания крови.5. Созданы полноатомные модели молекул Re-, Ra и S-LPS на базе силового поля OPLS-AA с использованием разработанной в нашей группе программыTppMkTop. Недостающие силовые параметры былирассчитаны с использованием методов. Силовые параметрыab initioацильных цепей валидированы в уравновешивающих расчетах бислоев из простых липидов с известной равновесий площадью на липид.6. Проведена серия МД расчетов для длинной цепи О-антигена (12 RU)в растворе.

В ходе расчетов показано, что переходы клубок-глобуладля длинной цепи обратимы в поле OPLS-AA (время жизни 10–40 нс)и необратимы в поле GLYCAM, что делает OPLS-AA предпочтительным силовым полем для моделирования S-LPS.7. В МД расчетах показано, что основным событием, ведущим к компактизации О-антигенаS. typhimurium20как в растворе, так и в мем-бранном кружении, является переход в-ψ состояние О-гликозидной связи между остатками маннозы и рамнозы. Для компактизации цепи в растворе достаточно перехода ∼ 3 % связей).

Повышеннаязаселенность этой конформации, по-видимому, носит энтропийнуюприроду и обусловлена структурой восстановленного остатка рамнозы.анти8. Созданы МД модели мицелл, состоящих из 4, 6, 8 и 14 молекул Re-,Ra- и O3-LPS, и показано, что увеличение длины углеводной частиЛПС в их составе ведет к стабилизации структуры за счет взаимодействия О-антигенных цепочек друг с другом. Показано, что увеличение количества молекул в составе мицеллы ведет к снижению площади гидрофобной поверхности, экспонированной в раствор.

Структура полученных агрегатов позволяет сделать предположение, чторассматриваемые ЛПСсклонны формировать ламеллярные структуры в растворе.S. typhimurium9. Построено две МД модели S-LPS мембран и показано, что структура О-антигенного слоя на их поверхности существенно зависит нетолько от среднего значения доступного объема, приходящегося наодну цепь, но и от равномерности распределения О-антигенных цепей в начальный момент времени.

Длинные цепи О-антигена в чистой ЛПС мембране образуют плотный слой, взаимодействуя другс другом преимущественно в вытянутом состоянии. В то же время, в белок-содержащей мембране происходит переплетение цепейО-антигена и формируется сложная гетерогенная структура с заполненными водой полостями с характерным размером ∼ 1 нм3, причемзапутывание О-антигенов на поверхности мембраны происходит за21счет взаимодействия их центральных частей.10.

Сконструированы три МД модели симметричных Re-LPS бислоев,состоящих из молекул, несущих два, один и ни одного остатка Ara4Nв составе липида А. Показано, что добавление Ara4N в состав ЛПС снебольшим размером гидрофобной части, ведет к увеличению равновесной площади, приходящейся на один липид (до 1.2 раза).

Такимобразом, модификации липида А влияют на плотность упаковки Оантигенных цепей на поверхности мембраны.Список литературы[1] J. Cohen // Nature. — 2002. — Vol. 420, no. 6917. — P. 885–91.[2] Ф. И. Атауллаханов, Г. Т. Гурия // Биофизика. — 1994. — Т. 39, № 1.— С. 89–95.[3] K. Guria, G. Guria // Thromb. Res. — 2015. — Vol. 135, no. 3. —P. 423–433.[4] M. A. Panteleev, N. M. Dashkevich, F. I.