Автореферат (Моделирование структуры липополисахаридов и их роли в процессе патологического свертывания крови), страница 2

typhimurium, как в растворе, так и в мембранном окружении, являетсяпереход в анти -ψ состояние О-гликозидной связи между остаткамиманнозы и рамнозы;∙увеличение длины углеводной части ЛПС в составе ЛПС-агрегатовведет к стабилизации их структуры за счет взаимодействия О-антигенных цепочек;∙увеличение количества молекул в составе мицеллы ведет к снижениюплощади гидрофобной поверхности, экспонированной в раствор;∙трехмерная организация О-антигенного слоя на поверхности мембраны в МД расчетах существенно зависит от начального распределенияцепей в плоскости мембраны;8∙присутствие остатка арабинозы в составе липидной части ЛПС может существенно увеличивать равновесную проекционную площадьЛПС в мембране.Личный вклад авторасостоял в систематизации литературных дан-ных, численном моделировании и теоретическом анализе математическихмоделей свертывания крови, а также в построении моделей и проведениирасчетов МД для ЛПС-содержащих систем и анализе полученных результатов.Апробация работы.Результаты работы были представлены научных конференциях (в том числе, наПубликации.812на-международных конференциях).По теме диссертации опубликовано6статей в рецензи-руемых изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus,RSCI.Структура диссертации.Диссертация состоит из введения,4 глав, со-держащих обзор литературных данных, описание методов, использованных в исследовании, и изложение и обсуждение результатов, а также заключения, списка литературы и приложения.

Работа изложена на 202 страницах и включаетчает30210 таблиц и 48 иллюстраций. Список литературы вклю-ссылки.Основное содержание работыВо введении к работе сформулирована актуальность рассматриваемой темы, цели и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость работы.9В первой главе приводится литературный обзор, посвященный экспериментальным и теоретическим аспектам динамики свертывания крови,роли ЛПС в этом процессе, а также обзор существующих данных о пространственной структуре ЛПС-агрегатов и ЛПС-мембран и о ее влияниина степень биологической активности ЛПС.Во второй главе описаны использованные методы.

Интегрированиереакционно-диффузионных моделей, описывающих основные реакции каскада свертывания крови, рассматриваемых в разд. 1 гл. 3, производилосьв среде MATLAB с использованием встроенного функционала pdepe. Моделирование распределенной системы, рассматриваемой в разд. 2 гл. 3,проводилось с помощью программы на C++, написанной аспирантом университета Лион 1 Анассом Бушнита. Кинетические модели активации контактного пути были проинтегрированы с использованием метода LSODAпрограммы COPASI.

Доказательства существования решений типа пульсв модели основных реакций каскада свертывания проводилось с помощьюметода Лере-Шаудера. МД расчеты были проведены с использованиемпрограммного пакета GROMACS версии 5.1.X в силовых полях OPLS-AAи GLYCAM. Для анализа конформаций полисахаридных цепей были рассмотрены двугранные углы вокруг О-гликозидных связей. Расчет недостающих параметров модели молекулы ЛПС проводился методами ab initioс использованием пакета Firely 8 в базисе 6-31G+(1p,1d) с функционаломB3LYP5 (DFT).В третьей главе проведен теоретический анализ различных стадийпроцесса свертывания крови: инициации, распространения и остановки роста тромба, а также переходных режимов с помощью математических моделей.

В разд. 1 гл. 3 рассматривается одномерная реакционно-диффузионная модель основных реакций каскада свертывания крови, описывающая10этап распространения волны концентрации тромбина:∂v1∂t∂v2∂t∂v3∂t∂v4∂t∂v5∂t∂T∂t∂ 2 v1+ k V T − hV v 1 ,∂x2∂ 2 v2= D 2 + kV III T − hV III v2 ,∂x∂ 2 v3= D 2 + kXI T − hXI v3 ,∂x∂ 2 v4= D 2 + kIX v3 − hIX v4 ,∂x∂ 2 v5∗= D 2 + kX v 4 + kXv 2 v 4 − hX v 5 ,∂x︂︂T∂2T∗= D 2 + (kII v5 + kIIv1 v5 ) 1 −− hII T.∂xT0=D(1)где T — концентрация тромбина, vi, i = 1, . .

. , 5 — концентрации факторовV, VIII, XI, IX и X, соответственно. Система монотонна, рассматриваетсядвуустойчивый случай. Если мы используем квази-стационарное приближение и выразим все переменные, кроме T , как функции T и подставляем их в первое уравнение, то стационарные точки полученного уравнения∂T∂t = ∆T +P (T ) (1*) совпадают со стационарными решениями системы (1),что позволяет нам сформулировать следующую теорему:Предположим, что P (T −) = 0 для некоторого T − > 0 иP ′ (0) ̸= 0, P ′ (T − ) ̸= 0.

Пусть w* — соответствующая стационарнаяточка системы (1). Если существует положительный корень полиномаP (T ) в интервале 0 < T < T − , то система (1) обладает монотонноубывающим автоволновым решением w(x, t) = u(x − ct) уравненияТеорема.Du′′ + cu′ + F(u) = 0, u(±∞) = w± ,(2)для единственного значения скорости c.Было доказано, что положительность скорости c в уравнении (2) является необходимым и достаточным условием существования стационарныхрешений типа пульс в системе (1), определяющим величину критического начального условия для начала распространения автоволны.

Скорость11распространения автоволныcв системе (1) приближена через аналитиче-ские оценки скорости автоволны в уравнении (1*), используя доказаннуютеорему:Теорема.Скорость распространения автоволны в системе (1) стре-мится к скорости распространения автоволны в уравнении (1*) при скоростях реакций правой части для всех факторов свертывания, крометромбина, стремящихся к бесконечности.В разд.2гл. 3 нами рассмотрена модель типа реакция-диффузия-конвекция активации внешнего пути при повреждении стенки сосуда.

Вмодели учитывается роль потока и пути активированного протеина C врегуляции роста тромба. Мы рассматривали переходные режимы междуполной и частичной закупоркой сосуда в зависимости от различных параметров системы с использованием численного моделирования (рис. 2 A,B)и теоретического анализа упрощенной модели. Основным результатом данной части работы является оценка критического размера повреждениястенки сосуда, равного∼ 90 мкм∼ 50мкм при скорости потокадля скорости потока1000 мкм/c400 мкм/си(рис.

2 C) для венулы диаметра50 мкм.В разд.3гл. 3 рассмотрена кинетическая модель активации контакт-ного пути ЛПС, построенная на основании доступных in vitro данных иучитывающая поверхностные эффекты, имеющие решающее значение дляактивации фактора XII и прекалликреина. Данная модель воспроизводитэкспериментальную зависимость наработки калликреина от концентрацииЛПС (рис. 2 D) и позволяет сделать предварительные выводы о влиянииагрегатного состояния ЛПС на активацию контактной системы.12Рис. 2: Режимы частичной (A) и полной (B) закупорки сосуда и размерсгустка при разных размерах повреждения (C) в модели активации внешнего пути.

Степень активации контактной системы для разных концентраций ЛПС в модели и эксперименте (D).400 нс расчетах в силовых поляхOPLS-AA (A) и GLYCAM (B) при температуре 300 K. Конформации цепиРис. 3: Радиус инерции цепи O-антигена визображены для расчетов, соответствующим красным графикам с шагомпо времени в50 нсЧетвертая глава посвящена моделированию пространственной структуры ЛПСS. typhimurium,их агрегатов и мембран методами МД. Струк-тура центрального олигосахарида и О-антигена этой молекулы, были рассмотрены в раннем модельном исследовании [20]. Структура Re-LPS былаполучена в нашей лаборатории с помощью методов масс-спектрометрии.Так как О-антиген является наиболее объемной и вариабельной частьюЛПС, то, в первую очередь, мы разработали две МД модели цепочки ОантигенаS. typhimuriumB с использованием силовых полей OPLS-AA иGLYCAM и проанализировали их конформационное поведение в раство13ре (разд.1).Наши модели продемонстрировали качественно новое кон-формационное поведение, которое не может быть выведено из анализадинамики более коротких олигосахаридов: в обеих моделях мы наблюдали образование шпилек и компактных глобул.

В обеих моделях основнойпричиной формирования шпилек является переход связи Man-Rha в состояниеAψ ,однако только в поле GLYCAM подобные переходы необра-тимы (рис. 3). Причина наблюдаемого различия лежит в существенно более низком значении свободной энергии состоянияоцененного нами по результатам1 мксанти -ψ Man-Rha связи,расчетов для дисахаридных фраг-ментов О-антигена, проведенных для обоих силовых полей (рис. 4). Дляоценки свободных энергий конформаций был использован метод расчетапотенциала средней силы (PMF), в основе которого лежит оценка относительных заселенностей различных конформаций (разд.1).

Анализ косвен-ных экспериментальных данных и сравнение полученных распределенийсвободной энергии с профилямиab initioэнергии позволяет нам сделатьвывод в пользу дальнейшего использования поля OPLS-AA для моделирования ЛПС-структур.Затем, используя в качестве основного параметр плотность упаковкимодельных липидов (ApL), была проведена валидация параметров моделилипидной части ЛПC (разд.2).Наилучшее соответствие эксперименталь-ным данным для простых фосфолипидов было достигнуто при использовании недавно опубликованного набора параметров [21] (рис.

5). Мы такжепровели корректировку отсутствующих в силовом поле параметров дляфрагментов полярной головки липида А и центрального олигосахарида сиспользованием методовab initio(разд.3). В частности, были рассчитаныпарциальные заряды атомов не описанных в поле фрагментов, а такжескорректированы параметры некоторых торсионных углов.14Рис. 4: Распределения свободной энергии, рассчитанные методом PMF, в(ϕ, ψ) для дисахаридов Gal-Man, Man-Rhaтемпературе 500 K. Расчеты проводились в си-координатах двугранных углови Rha-Gal в вакууме приловых полях OPLS-AA (верхний ряд) и GLYCAM (нижний ряд).