Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар (на примере белков), страница 3

1б. Такой процесс возможен в ЛДА парах, которыенаходятся в состоянии 4. После элементарного акта синглет-синглетнойаннигиляции молекула из состояния 4 переходит в состояние 3.В разделе 2.3 рассматриваются теоретические основы методовнелинейной и кинетической лазерной флуориметрии СОС при их возбуждениинаносекундными лазерными импульсами. Приводятся алгоритмы решенияобратных задач кинетической и нелинейной флуориметрии, результатомприменения которых является определение молекулярных фотофизическихпараметров флуорофоров СОС (сечения поглощения, скорости внутри- имежмолекулярного переноса энергии и др.) из кривых насыщенияфлуоресценции (Ф-1(F)=NRef/NFl, где NRef – реперный сигнал; NFl – сигналфлуоресценции) и кинетических кривых (I(tdel), где I – норм.

сигналфлуоресценции; tdel – задержка строба приемника относительно лазерногоимпульса). Указано, что данные методы позволяют производить диагностикубелковых молекул (в том числе содержащих ЛДА пару) в условиях дефицитааприорной информации, обязательной в традиционных методах.Третьяглавапосвященаэкспериментальномуопределениюфотофизических параметров природных макромолекул, содержащихлокализованнуюдонорно-акцепторнуюпару,методамилазернойфлуориметрии. В качестве объектов исследования были выбраны белок бычийсывороточный альбумин и флуоресцентный белок mRFP1. Каждая молекулаэтих белков содержит ЛДА пару, причем ансамбль последнего представляетсобой смесь нескольких неидентичных подансамблей молекул, содержащихЛДА пару. Предварительно методы лазерной флуориметрии былиапробированы на однофлуорофорных природных соединениях: триптофане вводном растворе и белке сывороточный альбумин человека.В разделе 3.1 описывается универсальный лазерный флуориметр/флуорометр (п.

3.1.1), позволяющий реализовывать нелинейную икинетическую флуориметрию. В отдельных пунктах описаны основные блоки иэлементы установки: система лазерного возбуждения на основе импульсногоИАГ:Nd лазера (1.06 мкм, частота следования импульсов 10 Гц) с наборомнелинейных кристаллов для получения гармоник основного излучения (532,355 и 266 нм); система регистрации, на основе стробируемого многоканальногоанализатора спектра с УФ CCD камерой (длительность строба – 10 нс, шагперемещения – 2.5 нс). Приведены основные характеристики лазерногоизлучения, показано, что распределения излучения в поперечном сечении пучкаи во времени хорошо аппроксимируются гауссовыми распределениями.Описана (п. 3.1.2) дополнительная аппаратура, которая использовалась вработе: пикосекундный лазерный флуорометр, спектрофотометр испектрофлуориметр.Раздел 3.2 посвящен определению фотофизических параметров молекултриптофана в слабоконцентрированном водном растворе при возбужденииимпульсами лазерного излучения с длиной волны 266 нм.11В п.

3.2.1 измеряются и анализируются спектры поглощения ифлуоресценции триптофана, делается вывод о необходимости учетадвухступенчатых процессов при обработке кинетических кривых и кривыхнасыщения.В п. 3.2.2 измеряются и анализируются кривые насыщения и кинетикираствора триптофана, из которых (решением обратной задачи по модели,представленной в разделе 2.1) определяются значения фотофизическихпараметров молекул триптофана:а) время жизни возбужденного состояния молекулы триптофана (вмоноэкспоненциальном приближении, при низком уровне возбуждения)τ3=(2.8±1) нс;б) сечение поглощения молекулы триптофана σ=(1.6±0.3)× 10-17 см2;в) суммарная скорость интеркомбинационной конверсии и ионизации изпервого возбужденного синглетного состояния S1 (K32+K3i)=(6±2)×107 с-1,которой соответствует сумма квантовых выходов в триплет и ионизации(ηT+ηi)=(0.17±0.05);г) суммарное сечение обратимого и необратимого фотопревращения припоглощении возбуждающего излучения (266 нм) молекулами в возбужденномсостоянии S1 (σ3i+σph)=(2.2±0.7)×10-18 см2.Таким образом, видно, что совместное применение нелинейной икинетической флуориметрии позволяет производить диагностику сложныхорганических соединений, фотофизические процессы в которых описываютсязначительным числом (в данном случае четырьмя) параметров.Раздел 3.3 посвящен определению фотофизических параметровтриптофан-содержащих белков, таких как сывороточный альбумин человека ибычий сывороточный альбумин в водном растворе, методами лазернойфлуориметрии.

Последний является представителем широкого класса объектов– макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару.В п. 3.3.1 производится измерение и анализ спектров поглощения ифлуоресценции этих белков. Из анализа спектров поглощения делается вывод отом, что в общем случае, не корректно сечению поглощения триптофановогоостатка в белке приписывать значение сечения поглощения свободноготриптофана в растворе, считая, что этот параметр является консервативным ислабо зависит от его окружения. Из анализа спектров флуоресценции делаетсявывод, что в БСА два флуорофора (триптофаны Trp134 и Trp212) находятся вразном локальном окружении.В п. 3.3.2, на основе материала, изложенного в п.

3.3.1 и литературномобзоре, делается вывод, что в ЛДА паре белка БСА донором энергии являетсяTrp212, а акцептором Trp134. Далее, измеряются и анализируютсякинетические кривые и кривые насыщения флуоресценции белков САЧ и БСА,из которых путем решения обратной задачи нелинейной и кинетическойфлуориметрии определяются фотофизические параметры флуорофора САЧ ифлуорофоров БСА. При обработке экспериментальных кривых использоваласьтрехуровневаямодельформированияфлуоресцентногоотклика,12представленная в разделе 2.1 (для САЧ), и модель коллективных состояний (1)(для БСА). При проведении экспериментов с белком БСА регистрацияфлуоресценции производилась на длинах волн 310 нм (при построениикинетических кривых и кривых насыщения флуоресценции донора) и 390 нм(при построении аналогичных кривых для акцептора).

Измеренные кривыенасыщения и кинетики для белка БСА представлены на рис. 2. Определенныезначения фотофизических параметров флуорофоров белков приведены втаблице 1.Рис. 2. Кривые насыщения (слева) и кинетические кривые (справа) для белкаБСА; квадраты – длина волны регистрации 390 нм, круги – 310 нм; линии –теоретические кривые, построенные по модели (1) для параметров,приведенных в таблице 1.Таблица 1. Фотофизические параметры флуорофоров белков БСА и САЧ.Белок Параметры*Trp214САЧτ3, нс4.5±1-172σ, 10 см1.3±0.2-1K32, с<10-7Trp1346.2±13±0.4Trp2125±11±0.2τ3, нсσ, 10-17 см2KDA, с-1<10-7KSS, с-1<10-7*в таблице:- τ3 - время жизни возбужденного состояния флуорофора;- σ - сечение поглощения флуорофора;- KDA и KSS – скорость переноса энергии с возбужденного донора (Trp212) наневозбужденный и возбужденный акцептор (Trp134), соответственно.БСАВ раздел 3.4 описан основанный на лазерной флуориметрии (совместномприменении нелинейной и кинетической флуориметрии) комплексный метод13определения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоровподансамблей ЛДА пар флуоресцентных белков.

Для белка mRFP1 какпредставителя природных объектов с ЛДА парами установлена схемафотофизических процессов и определены: доля молекул каждого подансамбляЛДА пар в конечном препарате белка, фотофизические параметры ЛДА пар.В п. 3.4.1 измеряются и анализируются спектры поглощения,флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекулфлуоресцентного белка mRFP1. Показано, что возбуждение раствора белкаmRFP1 УФ светом (270 нм) приводит к появлению не только флуоресценции вУФ области (максимум 330 нм), которая соответствует флуоресценциитриптофана белковой матрицы, но и флуоресценции в видимом диапазоне(максимум 607 нм).

Таким образом, молекула белка mRFP1 представляет собойобъект с ЛДА парой, донором возбуждения в которой является триптофанматрицы белка, а акцептором – хромофор белка, причем данные стационарнойспектроскопии свидетельствуют о наличии эффективного переноса энергиивнутри ЛДА пар.Показано, что конечный препарат белка mRFP1 - это ансамбль молекул сЛДА парой, состоящий из трех подансамблей, молекулы которых условнообозначаются как R, G и B формы белка. Действием внешних факторов(изменением кислотности раствора и облучением светом с длиной волны488 нм (п. 3.4.2)) можно сократить количество форм белка до двух (R и G или Rи B).В п. 3.4.3 разработан метод, основанный на совместном примененииабсорбционной спектроскопии и наносекундной лазерной флуориметрии свозбуждением на длине волны 532 нм. Метод позволил сформировать первыйблок информации, описывающий фотофизические процессы в подансамбляхЛДА пар белка mRFP1, а именно, индивидуальные фотофизические параметрыакцептора ЛДА пары (хромофора белка) в каждой из трех форм белка: сечениепоглощения, квантовый выход в триплетное состояние (только для R формы),квантовый выход флуоресценции (только для R формы) и время затуханияфлуоресценции (только для R формы).

Помимо этого, определяетсясоотношение концентраций молекул трех подансамблей ЛДА пар в общемпрепарате белка.Разработанный метод имеет практическое значение как метод контролянаправленного мутагенеза mRFP1 и поиска мутантов белка с необходимымидля конкретных применений оптическими свойствами. Информация,получаемая методом, также необходима для определения остальныхфотофизических параметров (п. 3.4.5), фигурирующих в предложенной моделиколлективных состояний (1).В п. 3.4.4 изложенный в п. 3.4.3 метод применен для определениявлияния на соотношение концентраций и индивидуальные фотофизическиепараметры хромофора белка mRFP1 точечных мутаций по 66 положению:белки mRFP1/Q66S и mRFP1/Q66C. Показано, что индивидуальные значениякоэффициентов экстинкции хромофоров коррелируют с объемами боковыхрадикалов по 66 положению (коэффициент корреляции >0.9).14В п.

3.4.5 развит метод, формирующий второй блок информации,описывающей фотофизическаие процессы в подансамблях ЛДА пар белкаmRFP1, а именно, скорости переноса энергии с донора на акцептор в ЛДА парекаждой из трех форм белка и время внутрихромофорной релаксации донора(для B и G форм). Для этого разработанный в п. 3.4.3 метод был дополненизмерениями кривых насыщения и кинетических кривых (с пикосекунднымвозбуждением) при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 266 нм.Регистрация флуоресценции при этом производилась в УФ (флуоресценцияакцептора ЛДА пары, максимум на 330 нм) и видимой областях спектра(флуоресценция донора ЛДА пары, максимум на 607 нм). Для уменьшениячисла одновременно присутствующих в растворе форм белка (для облегченияанализа данных лазерной флуориметрии) применялась процедура,предложенная в п.п.