Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар (на примере белков), страница 2

Медицинская физика и инновации в медицине(Троицк, май, 2006); Международная научная конференция студентов,аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2006” (Москва, апрель, 2006);6Международная конференция “Lasers, Applications and Technologies (LAT2007)” (Минск, май-июнь, 2007); Международная конференция “LaserApplications in Life Sciences (LALS 2007)” (Москва, июнь, 2007).По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 8статей, 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК России,и 6 тезисов докладов на конференциях. Список работ приведен в концеавтореферата.Структура и объем диссертацииДиссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения исписка литературы. Объем диссертации 125 страниц, в том числе 49 рисунков,6 таблиц.

Список литературы включает 130 наименований.Личный вклад автораВсе результаты в диссертации получены автором лично, либо при егоопределяющем участии.Исследования возможностей применения разработанных методов вбиотехнологии флуоресцентных белков выполнены совместно с П.В.Вржещеми Е.П.Вржещем, представляющими Международный биотехнологическийцентр МГУ им. М.В. Ломоносова.СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИВо введении обосновывается актуальность темы диссертации,формулируются цель и задачи исследований, приводятся положения,выносимые на защиту, кратко излагается содержание диссертации.В первой главе дан анализ литературы, посвящённой применениюфлуоресцентной спектроскопии для исследования и диагностики ансамблейЛДА пар.

Особое внимание уделено флуориметрии белков как, по-видимому,наиболее интересного и важного в практическом плане представителя такогорода систем. По этой причине в обзор включена информация и о структуребелков, макромолекулы которых содержат ЛДА пары и которые выбраны вработе в качестве объектов.В разделе 1.1 описываются основные типы (искусственно созданные иприродные), свойства и области применения объектов, содержащих ЛДА пару.В п.п. 1.1.1, 1.1.2 приводятся примеры объектов с ЛДА парой (п. 1.1.1),рассматриваются примеры изучения структурной организации органическихсоединений с использованием искусственных ЛДА пар, отмечаются основныетрудности, которые возникают при этом (п.

1.1.2).В п. 1.1.3 анализируются перспективы использования природных системс ЛДА парой на основе белков как индикаторов процессов в живых системах.В разделе 1.2 представлены общие сведения о собственнойфлуоресценции белков. Даны сведения о флуоресцентных свойствах и7структуре белков сывороточный альбумин человека (САЧ) и бычийсывороточный альбумин (БСА).В п. 1.2.1 рассмотрены основные спектральные свойства природныхфлуорофоров белков (аминокислот триптофан, тирозин и фенилаланин) вводном растворе и в структуре белковой матрицы.

Особое внимание уделенопараметрам триптофановой флуоресценции как наиболее информативной приизучении свойств белковых молекул методами флуориметрии.В п. 1.2.2 даны сведения о строении белков САЧ и БСА. Представленамодель трехмерной структуры молекулы этих белков (модель “сердца”).Приведена информация о параметрах флуоресценции этих белков, котораяопределяется одним триптофановым остатком для САЧ (Trp214) и двумя - дляБСА (Trp134 и Trp212).

Отмечено, что белок БСА является представителемширокого класса объектов – природных макромолекул, содержащих ЛДА паруфлуорофоров (два триптофановых остатка).В п. 1.2.3 рассмотрены фотохимические процессы, которые возникают вмолекулах свободного триптофана и триптофан-содержащих белков привоздействии на них УФ света; описаны механизмы фотоионизации (одно- идвухступенчатой) и фотодеградации, свойственные этим объектам.В разделе 1.3 представлены сведения об особом классе белков флуоресцентных белках (ФБ), представители которого обладают следующимиотличительными свойствами:1.

в отличие от других известных природных макромолекул данныебелки формируют внутренний хромофор (особый участок белковойцепи), без каких бы то ни было вспомогательных кофакторов иферментов (кроме молекулярного кислорода);2. полосы поглощения и флуоресценции хромофора этих белков лежат ввидимой области спектра.Данные белки являются в настоящее время популярнымифлуоресцентными маркерами для работ in vivo.В п. 1.3.1 описаны спектральные свойства и трехмерная структурафлуоресцентных белков, на примере зеленного (GFP, максимум флуоресценциина 508 нм) и красного (DsRed, максимум флуоресценции на 583 нм)флуоресцентного белка. Указано, что каждая мономерная субъединицамолекулы этих белков (молекула белка не являются мономером) содержит ЛДАпару: триптофан в матрице белка и хромофор белка.В п. 1.3.2 уделено внимание процессу формирования хромофора(созреванию) флуоресцентных белков (на примере белков GFP и DsRed).Процесс созревания ФБ - это сложный процесс, который проходит в несколькостадий.

На некоторых стадиях созревания ФБ образуются промежуточныеинтермедиаты (формы) белка, способные сохранять свое присутствие и вконечном препарате белка. A priori препарат ФБ представляют собой смесьнескольких неидентичных и как следствие, различающихся спектральнымисвойствами форм белка, т.е. ансамбль молекул ФБ является совокупностьюнескольких неэквивалентных подансамблей молекул, содержащих ЛДА пару.8В п. 1.3.3 даны сведения о спектральных свойствах красного (максимумфлуоресценции на 607 нм) ФБ mRFP1, который является улучшенныманалогом (мутантом) белка DsRed, не проявляющим склонности колигомеризации и тетрамеризации.

Отмечено, что в настоящее время ведутсяработы по получению ФБ (в том числе и на основе белка mRFP1) сулучшенными свойствами.Вторая глава посвящена созданию модели, описывающей кинетикунаселенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющей рассчитыватьфлуоресцентный отклик ансамбля локализованных ДА пар при его лазерномвозбуждении.В разделе 2.1 на основе литературных данных приведена необходимаядля изложения оригинальных результатов информация о флуоресценции СОС.Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика СОС для случаядвухкомпонентной смеси однофлуорофорных молекул СОС такой, что междукомпонентами возможен межмолекулярный перенос энергии.

Рассмотренамодельформированияфлуоресцентногооткликавслучаеслабоконцентрированного однофлуорофорного раствора СОС со спецификой,свойственной водному раствору триптофана. Выписаны системы кинетическихуравнений для населенностей энергетических уровней СОС, которыеиспользуются в гл. 3.В разделе 2.2 разрабатывается модель, описывающая флуоресцентныйотклик ансамбля ЛДА пар (в предположении, что возбуждение происходитнаносекундными импульсами лазерного излучения) с учётом переноса энергиис возбужденного донора на: а) невозбужденный акцептор; б) возбужденныйакцептор (синглет-синглетная аннигиляция).Введем обозначения S0D, S1D – основное и первое возбуждённоесинглетные состояния донора, S0A, S1A – синглетные состояния акцептора.Молекулы СОС, содержащие ЛДА пару, под действием излучения могутнаходиться в одном из четырех состояний:Состояние 1 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии S0D иS0A – концентрацию таких молекул будем обозначать n 1 ≡ n 1 ( t, rr ) ;Состояние 2 - донор молекулы находится в состоянии S1D, а ее акцептор вS0A - концентрацию таких молекул будем обозначать n 2 ≡ n 2 ( t, rr ) ;Состояние 3 - донор молекулы находится в состоянии S0D, а ее акцептор вS1A - концентрацию таких молекул будем обозначать n 3 ≡ n 3 ( t, rr ) ;Состояние 4 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии S1D иS1A – концентрацию таких молекул будем обозначать n 4 ≡ n 4 ( t, rr ) ;Определенные таким образом состояния будем называть коллективнымисостояниями ЛДА пары.

Динамика изменения концентраций приведенныхвыше четырех коллективных состояний ЛДА пары математически описываетсяследующей системой кинетических уравнений:9n2 n3 ∂n 1r=−⋅σ+σ⋅++F(t,r)()nDA1 ∂tτ 3D τ 3A ∂nnnrr 2 = − F( t, r ) ⋅ σ A ⋅ n 2 − D2 − K DA ⋅ n 2 + F( t, r ) ⋅ σ D ⋅ n 1 + A4τ3τ3 ∂tn3n4 ∂n 3rr= − F( t, r ) ⋅ σ D ⋅ n 3 − A + F( t, r ) ⋅ σ A ⋅ n 1 + D + K DA ⋅ n 2 + K SS ⋅ n 4∂tτ3τ3∂nnnrr 4 = F( t, r ) ⋅ σ A ⋅ n 2 + F( t, r ) ⋅ σ D ⋅ n 3 − 4 − 4 − K SS ⋅ n 4 ∂tτ 3D τ 3An 1 + n 2 + n 3 + n 4 = n 0 ,(1)где символы D и A относятся к донору и акцептору соответственно; n0 – полнаяконцентрация молекул СОС; σD - сечение поглощения донора, σA - сечениепоглощения акцептора, соответствующие переходу S0→S1; KDA – скоростьпереноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный акцептор; KSS скорость переноса энергии с возбужденного донора на возбужденный акцептор(синглет-синглетная аннигиляция); τ3 - время жизни флуорофора вrвозбужденном состоянии; F( t, r ) – плотность потока фотонов возбуждающегоrизлучения в момент времени t в точке с координатой r = {x, y} в плоскости,перпендикулярной направлению падающего излучения (зависимостьюпараметров от координаты z вдоль направления пучка пренебрегаем, т.е.используем приближение оптически тонкого слоя).Описанные четыре возможные коллективные состояния можнопроиллюстрировать следующими энергетическими диаграммами, рис.

1а.а)б)Рис. 1. а) коллективные состояния локализованной донорно-акцепторной пары(без учета синглет-синглетной аннигиляции); б) процесс синглет-синглетнойаннигиляция в модели коллективных состояний (переход S2A→ S1A происходитза времена порядка пикосекунд).10Перенос энергии по механизму синглет-синглетной аннигиляции впредложенной модели четырех коллективных состояний схематическиизображен на рис.