Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар (на примере белков)

На правах рукописиБАНИШЕВ Александр АлександровичЛАЗЕРНАЯ ФЛУОРИМЕТРИЯ АНСАМБЛЕЙ ЛОКАЛИЗОВАННЫХДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫХ ПАР (НА ПРИМЕРЕ БЕЛКОВ)Специальность: 01.04.21 - Лазерная физикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМ о с к в а – 2008Работа выполнена на кафедре квантовой электроники физического факультетаМосковского государственного университета имени М.В.

ЛомоносоваНаучный руководитель:доктор физико-математических наук,профессор Фадеев Виктор ВладимировичОфициальные оппоненты:доктор физико-математических наук,профессор Саркисов Олег Михайловичдоктор физико-математических наук,доцент Чикишев Андрей ЮрьевичВедущая организация:Институт спектроскопии РАН2008 года вчасов на заседанииЗащита состоится “ 22 ” маядиссертационного совета Д501.001.31 в Московском государственномуниверситете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, г.

Москва,Ленинские горы, МГУ, ул. Академика Хохлова, д.1, корпус нелинейной оптики,аудитория им. С.А.Ахманова.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультетаМГУАвтореферат разослан “” апреля 2008 г.Ученый секретарьдиссертационного совета Д501.001.31кандидат физ.-мат. наук, доцентИльинова Т.М.2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность исследованияФлуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется висследованиях сложных органических соединений (красителей, белков,фотосинтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.). Однакотрадиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладаютограниченнымиинформационнымивозможностямиванализефлуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосыфлуоресценции большинства органических соединений при комнатнойтемпературе широкие и бесструктурные), поэтому данных, получаемых этимиметодами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации идиагностики сложного органического соединения (СОС).

Задача диагностикиСОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одногофлуорофора.Интересным и важным для практического применения подклассоммногофлуорофорныхсистемявляютсямолекулярныеобъектыслокализованной донорно-акцепторной (ЛДА) парой – макромолекулы,содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможенперенос энергии возбуждения.

Объекты подобного рода играют большую рольв получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: ихпространственной организации, размерах, состоянии микроокружения и т.д., атакже изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях. Вчастности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей(меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основетак называемой «спектроскопической линейки», используемой для измерениярасстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения измененияконформаций, например, в белках, ДНК, полимерах.

К объектам с ЛДА паройможно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорныекрасители.Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДАпарами являются их собственные флуорофоры. В этом случае не возникаетпроблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА)парам: неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток,стабильность комплекса молекула-метка и т.д. К числу таких объектовотносятся многие типы белков. Их удобно использовать в качестве модельныхобъектов, содержащих локализованную пару флуорофоров.

Но белкипредставляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компонентыживых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, чтооткрывает возможность использования белков в качестве индикаторовпроцессов в живых системах.При анализе белковой флуоресценции ограничения традиционнойфлуориметрии становятся особенно ощутимыми, т.к. флуоресценция белковможет зависеть сразу от несколько факторов. Более того, белковая молекулачастоизначальносодержитнесколькофлуоресцирующих(и/или3поглощающих, но не флуоресцирующих) центров, а препарат белка (ансамбльмолекул) представляет собой смесь нескольких, спектрально неидентичных,подансамблей молекул белка.

Это приводит к тому, что получаемыетрадиционными флуоресцентными методами данные сложны для однозначнойинтерпретации и позволяют сделать, в основном, лишь качественные выводы овнутреннем состоянии объекта. Поэтому задача получения количественнойинформации in vivo, без каких-либо препаративных воздействий на объект, вряде случаев не может быть решена методами классической флуориметрии.Возможности флуоресцентного анализа СОС значительно расширяются сприменением лазерных методов, которые в дополнение к традиционнымпараметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции,позволяют определять молекулярные фотофизические параметры флуорофоров(время жизни, сечение поглощения, скорость межмолекулярного переносаэнергии и др.) в условиях дефицита априорной информации, обязательной вклассических методах.

Эти параметры могут быть использованы в качестведиагностических признаков.Разработка новых эффективных подходов к исследованию свойствмногофлуорофорных объектов и методов их диагностики в условияхокружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладнойзадачей. Разрабатываемые применительно к белкам инструментынеобходимы в различных биологических и медицинских исследованиях ив перспективе, по-видимому, могут найти свои применения в практическоймедицине.Цель работыЦелью работы является развитие новых подходов, которые открываются сприменением к природным ансамблям с ЛДА парами лазерной флуориметрии –нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) и кинетическойфлуориметрии в нано- и субнаносекундном диапазонах.В качестве объектов исследования были выбраны: белок бычийсывороточный альбумин (БСА), в каждой из молекул которого содержится параприродных флуорофоров – триптофановых остатков, и флуоресцентный белокmRFP1 (monomeric Red Fluorescent Protein), в ансамбле молекул которогоприсутствуют три подансамбля ЛДА пар.

Предварительно методами лазернойфлуориметрии были исследованы однофлуорофорные природные объекты:триптофан в воде и белок сывороточный альбумин человека ((САЧ) каждаямолекула которого содержит один триптофановый остаток).В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:1. Построить модель, описывающую флуоресцентный отклик ансамблей ЛДАпар при их импульсном лазерном возбуждении.42. Разработать основанный на совместном применении нелинейной икинетической флуориметрии метод определения фотофизических параметровфлуорофоров в ЛДА парах.3. Апробировать методы лазерной флуориметрии на однофлуорофорныхобъектах и получить фотофизические параметры их флуорофоров.4.

Провести экспериментальную проверку построенной модели иразработанного метода на примере природного моноансамбля с ЛДА парой(двухтриптофановом белке – БСА): получить кривые насыщения и кинетикифлуоресценции, определить из них индивидуальные фотофизическиепараметры донора, акцептора и скорости переноса энергии между ними (свозбужденной молекулы донора как на невозбужденную, так и навозбужденную молекулу акцептора).5. Провести экспериментальную проверку построенной модели иразработанного метода на примере природного объекта (флуоресцентногобелка), ансамбль молекул которого является совокупностью нескольких (трех)подансамблей с ЛДА парой: получить кривые насыщения флуоресценции,определить долю каждого подансамбля в общем ансамбле, определитьиндивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скоростипереноса энергии в локализованной паре для каждого подансамбля.Научная новизна работыПредложена модель фотофизических процессов в молекулярныхобъектах с ЛДА парой, адекватно описывающая флуоресцентный откликфлуорофоров при возбуждении импульсами лазерного излучения.

Введенопонятие коллективных состояний ЛДА пары. Предложена модель,описывающая кинетику населенностей этих состояний и позволяющаярассчитать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамбля ЛДА пар.Впервые совместно реализуемыми на одном лазерном спектрометреметодами наносекундной кинетической и нелинейной флуориметрииопределенызначенияиндивидуальныхфотофизическихпараметровфлуорофоров белков mRFP1, бычьего сывороточного альбумина исывороточного альбумина человека. Для первых двух, на основе предложенноймодели, впервые определена константа переноса энергии междуфлуорофорами.

Для mRFP1 определены парциальные концентрациипосттрансляционных форм белка.Научная и практическая значимостьПредложенная методика определения фотофизических параметров, вчастности, скорости переноса энергии в природных системах с ЛДА парамиоткрывает новые возможности использования их в качестве сенсоров в живыхорганизмах. Определение индивидуальных фотофизических параметровмолекул каждого из подансамблей флуоресцентных белков может быть5применено для контроля свойств получаемых флуоресцентных белков.Развитый подход, основанный на измерении фотофизических параметровфлуорофоров белков in vivo, может применяться для изучения процессов вживых системах, а значения фотофизических параметров, полученные дляконкретных объектов, использованных в работе – для диагностики конкретныхбиологических систем, содержащих эти белки.Положения, выносимые на защиту1.

Совместное применение наносекундной кинетической и нелинейнойлазерной флуориметрии позволяет одновременно определять значениявсех основных фотофизических параметров молекул триптофана в воде(сечения поглощения в основном и возбужденном синглетномсостояниях; время жизни возбужденного состояния; сумма скоростейинтеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации извозбужденногосинглетногосостояния)итриптофанаводнофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека (сечениепоглощения; время жизни возбужденного состояния; скоростьинтеркомбинационной конверсии).2.

Разработанная модель коллективных состояний локализованной донорноакцепторной (ЛДА) пары позволяет описать флуоресцентный откликансамбля ЛДА пар при лазерном возбуждении.3. Разработанным методом, использующим нелинейную и кинетическуюлазерную флуориметрию, по предложенной модели коллективныхсостояний ЛДА пары, могут быть определены значения индивидуальныхфотофизических параметров ее флуорофоров, в частности, значенияфотофизических параметров (сечения поглощения и времена жизнидонора и акцептора пары; скорость переноса энергии с возбужденногодонора на невозбужденный и возбужденный акцептор) флуорофоровбелков mRFP1 и бычий сывороточный альбумин, которые являютсяпредставителями природных объектов с ЛДА парой.

Для белка mRFP1может быть определена доля молекул каждого подансамбля в общейсмеси трех типов ЛДА пар.Апробация работы и публикацииРезультаты работы докладывались на следующих конференциях:IV Всероссийскаяконференция“Физическиепроблемыэкологии(Экологическая физика)” (Москва, июнь, 2004); Международная конференция“Opto-Ireland 2005” (Дублин, апрель, 2005); IV Международная конференциямолодых ученых и специалистов “Оптика-2005” (Санкт-Питербург, октябрь,2005); II Троицкая конференция.