Отзыв официального оппонента кандидат физико-математических наук Кириллина М.Ю (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов)

ОТЗЫВофициального оппонента на диссертацию Кисуна Ли, выполненную на тему«Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию:исследование с помощью лазерных пинцетов» и представленную насоискание ученой степени кандидата физико-математических наук поспециальности 03.01.02 – «биофизика»Диссертационная работа Кисуна Ли посвящена изучению взаимодействияэритроцитов при их агрегации на уровне индивидуальных клеток с использованиемлазерного пинцета.Изучение особенностей агрегации эритроцитов является актуальной задачейсовременной биофизики, тесно связанной с клинической гемореологией.

Агрегацияэритроцитов интересна как с точки зрения фундаментальной науки, в частиисследования механизмов взаимодействия клеток, так и с точки зрения клиническойпрактики в силу информативности параметров агрегации и микроциркуляции кровипри диагностике социально значимых заболеваний.В диссертационной работе Кисуна Ли сделан важный шаг в развитиифундаментального представления о процессе агрегации эритроцитов.

В работе дляизучения агрегации использована комбинация оптических методов: в качествеосновного инструмента используется лазерный пинцет, позволивший в последнеевремя значительно развить представления о взаимодействии различных клеток и дажемакромолекул; для контроля положения эритроцитов в пространстве и определения ихплощади перекрытия используется оптическая микроскопия.Диссертационная работа Кисуна Ли представлена на 95 страницах, содержит 4главы, включает подробный обзор литературы, описание принципов разработаннойметодики измерения силы взаимодействия эритроцитов, полученные результаты,обсуждение и выводы, список литературы из 143 наименований.В главах последовательно обсуждаются значимость агрегации эритроцитов какфизиологически важного процесса; общие методы изучения процесса; основныегипотезы о механизмах взаимодействия клеток; метод изучения взаимодействия клетокс использованием лазерного пинцета.

Описаны протоколы проведения измерения, втом числе разработанные автором; результаты обширной серии экспериментов поизмерению сил взаимодействия клеток в различных средах, индуцирующих агрегациюэритроцитов, на уровне отдельных клеток. Проведено сравнение полученных авторомрезультатов с данными других исследовательских групп. Предложена новая гипотеза,состоящая в том, что полученные в работе кинетики взаимодействия эритроцитовмогут быть объяснены с помощью модели «подвижных мостиков».Взаключениеавторперечисляетосновныерезультатыпроведеннойэкспериментальной работы, характеризует новизну полученных данных и предлагаетновую гипотезу о механизме взаимодействии клеток.К наиболее интересным результатам, полученным автором, на мой взгляд, вопервых, следует отнести то, что автором впервые обнаружено значительное отличиемежду силой, возникающей между парой эритроцитов при спонтанной агрегации, исилой, необходимой для дезагрегации парного агрегата эритроцитов, при разныхкомпонентных составах буферной среды.

Это является значимым результатом, учеткоторого может изменить общие представления о процессе обратимой агрегацииэритроцитов. Во-вторых, автором впервые проведено подробное исследованиезависимости динамики взаимодействия пары эритроцитов в растворах различныхмакромолекул от длительности и площади их взаимодействия. Показаны особенностивзаимодействия, характерные для различных растворов. Важно подчеркнуть, что всерезультаты получены при усреднении по многим парам эритроцитов, из чего следуетвывод о большом объеме проведенных измерений.Однако текст диссертации вызывает ряд замечаний и вопросов:1) Все результаты автора получены при работе с клетками с помощью сильносфокусированноголазерногопучка.Приэтомдетальногоописанияоценкивоздействия излучения на эритроцит не приводится, а даются только краткие оценкипо нагреву клетки, основанные на результатах других авторов.

Более того, оценкиприводятся только исходя из мощности пучка лазерного пинцета, а не изинтенсивности облучения поверхности эритроцита, хотя как раз интенсивность играетрешающую роль при оценке биологического воздействия излучения.2) Основным методологическим недостатком работы является отсутствие в текстеработы калибровочных кривых, позволяющих оценить диапазон рабочих мощностейиспользуемых пинцетов, диапазон измеряемых сил и линейность зависимости силызахвата от мощности пучка лазерного пинцета. В тексте также отсутствует обсуждениепогрешности измерения силы взаимодействия, связанной с калибровкой системы.Также в калибровочном эксперименте при оценке силы захвата автор используетформулу, предполагающую, что эритроцит имеет форму эллипсоида, в то время как вреальности он имеет форму двояковогнутого диска.

Погрешность, вносимая этимпредположением, также не обсуждается в тексте работы.3) В работе измерения проводятся при комнатной температуре 25°С хотяфизиологическая температура это 37°С. Автор в литературном обзоре сам приводитданные об зависимости параметров агрегации эритроцитов от температуры. При этомзависимость ярко выражена и в области от 25 до 37 °C. Насколько результаты автораполученные при 25°С достоверны и применимы для физиологической температуре?Как обосновывается то, что наблюдаемый эффект не есть на самом деле проявлениетемпературной зависимости?4) Во Введении автор утверждает, что «Агрегация эритроцитов (АЭ) – это обратимыйпроцесс образования и разрушения агрегатов эритроцитов, который в значительноймере определяет вязкость крови при низких сдвиговых напряжениях».

Вообще говоря,процесс разрушения агрегатов не входит в понятие агрегации и называетсядезагрегацией.5) При описании принципов оптического захвата эритроцита утверждается, что«эритроцит разворачивается под действием силы захвата так, что большая осьсимметрии совпадает с оптической осью пучка». Вообще говоря, у эритроцита естьтолько одна ось симметрии, и при захвате она оказывается перпендикулярной осипучка.6) При обсуждении рис.

3.3(в) утверждается, что «силы взаимодействия практическине изменяются», однако множество точек, соответствующих эксперименту с плазмойпозволяет предположить, что сила растет с увеличением времени взаимодействия.Необходимо отметить, что приведённые выше замечания не влияют на оценкуосновных результатов диссертации, а возникающие вопросы скорее представляютинтерес для научной дискуссии.Ha)nrHo-r,rccJreAoBarenbcKr4M,{ucceptaql{oHHtul pa6ora Kracyna IIu sr'rserlct 3aKoHrreHHbrMTpy,qoM, BbInoJrHeHHbM aBTopoM caMocTosTeJrbHo HaflonyuennrreBbTCoKOMHayqHOM ypOBHe.aBTopoM pe3yJlbrarbl, BbIBoAbI u 3aKJrroqeuns o6ocuoBaHbr. Anrope$eparcoorBercrByer ocHoBHoMy coAepx(aHrrlo Al{cceprarlzu.

flucceprarlrloHHar pa6ora orBeqaertpe6oeaHusna flonoNeHr{so rrp]rcyxleHl4l{yqeHbrx crerreHeir, a ee aBTop, Kucyn JIn,3acnyxllBaer [prlcyxAeHzryqeHoft creleHl,I KaHAr4Aara(pnsuro-uareMarr.rqecKnx HayK rrocreqlraJrbHocru 03.01 .02 - <<6no1pn:urca>./-\-V,. aoQuqr.ranrsnrftonnonenrCrapurraftnayrurft corpy,unr{KI4lI@ PAH,KaHAr,rAarHayKSusuxo-uareMarr,rqecKr{xIfVl\XKupurnuuMraxaurlOpreuEu\ J\\\26.04.2016OfBHy <Oe4epamsrrft uccle.{oBarenbcKuftqeurpI4uctnryr rpr,rKJraAHoftft at<a1elur{HayK))$usraxuPoccuficr<o603950,r. HuNsnft Honropo4.Eorc l20,yn. Ynrruona,46.Teu.

7(831)41 64619e-mail: kirillin@ufp.appl.sci-nnov.rufloAur,rcrKupunnnuaMuxannaYqennft ceKperapbPI|IOKaHAr4Aar(pus.-uar. n3aBeprrc.IrI.B.Koprorrau.