Отзыв официального оппонента 2 (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli)

О'$ЗЫВ Официальното оппонента на диссертационну~о работу Кузьминой Натальи Виитороииы ИАтомио-еиловаа микроскопия сигма(70) — еубьедииицы РНК-полимеразы Е.сой», предстанленную на сОискание ученой степени кандидата физико"математических наук по специальности 03.01.02 — «Биофизика», 03.01.08 — «Биоинженерий» систематическое изучение морфолосии и физи~ескиХ СВОЙСТВ асре~атоВ бел~а о~л — субъединицы РИЕ-полимеразы К сой, получены новые данные о Работа Н.В.

Кузьминой иалиетеи Визуальной, поскольку В ней исследунттсй Особенности ~тр~ений и функционироааний о' — суоъединицы РНК вЂ” полнмеразы Е, СОЙ, Ва~кных длй пониманий молекулйрных МСХанизМОВ прокарнотической транскрипции. Исследойанне агретацин О' --субъединицы СОВременным Высокоразрец1акнцим Ме~од~М АСМ В е~т~с~аенноЙ жидКОЙ окру®аннцей среде позаолнло продаинутьсй В понимании ретулйции процессОВ формироВаний амилоидных фиОрилл и самООрсанизации их В более сложные иерархические структуры, Научиаи значимость работы определйетсй тем, что определение морфололии амилоидных асресатоВ О" — субъединицы РИК-полимеразы Е.

по~В~ЛЯ~~ Вылвить неко*орые Обилие ~а~~~~мерно~т~ формир~ваниЯ амилОидных стРУкттР разных типОВ ОелкОВ и их урОвней ОРГанизации и ~риб~и~ит~~я к пониманикз регуляции зтого проц~с~~. Опр~д~~е~~е геометрических размеров и механических характеристик амилоидных структур Открывает нОВые перспектиВы для МОлекулярнОГО конструирования синтетических материалОВ. ПРВ$л ическая ценность определяется Возможностью использоВания способности амилоидов к самоорганизации наряду с их г1ластичностькз для конструирования стр~ител~ных блоков для Созданил ~ОНЫХ наноструктур и наноматериалов длЯ органической нанозлектроники, биоорганических нанопроводОВ„адреснОЙ доставки диаГнОстических и лекарственных средств при лечении различных забОлеВаний и дру'Гих медицинских приложений.

Работа состонз из В~едения, четырех глав, результатов и ~ЫВОДОВ. списка литературы, В~~вес евин обоснована еетуеииеносте ееиы иасвевоввний. СфОРМУЛИРОВВНЫ ЦЕЛИ И ОСНОВНЬГЕ зада~и Работые ИЗЛОЖЕНЫ Основные ПОЛОЖЕНИЯе ВЫНОСИМЬГЕ На ЗВГЦИТУт а ТВКЖЕ ОПРЕДЕЛЕНЫ НауЧНВЯ НОВИЗНВ, практическая и теОретическая значимость РезультатоВ исследОВания, ВРГУМЕНТИРована ДОСТОВЕРНОСт~в ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТВТОВ. Здес~ ЖЕ Дана информация ОО апробации и личнОм Вкладе ВВтора диссертации, публикациях по теме и~след~вани~, Крат~о О~исаны структура и содержание диссертации. Пе2Вая гле1ВВ яВляется ОбзОрноЙ, В ней приВедены сведения О строении РНК вЂ” полимеразы, образовании агрегатов Оз~ — субъединицы и процессе агрегации оелков В целом.

Описаны характерньге признаки амилоидных фибрилл, способы организаации в более сложные формы глобулярных белков, о~ерчены Основньге пути биоинженерных направлений их использования. Рассмотрены основньге принципы рабо*ы АСМ, используемьге подложки. Проведено сопоставление результатов АСМ-исследований полиморфизма амилоидов пО литературным данным.

пзлочкообразнои з~ регации О'о-сзбъединицы РНК-полнмеразы Е.сой. Описана методика при~отовл~ни~ образцов о' -субъединицы и ~~д~~ия изчерений методами АСМ и ПЭМ. Выполнен большой объем работ по АСМ- исследовзнн1О О "субъеднницы и ее чутантОВ В Воздушной среде н жидкости 70 в зависимости От кОнцеьнтрзции рзстВОРОВ, Времени хранения белка. Анализ АСМ-изображений и гистограмч распределений по размерам позволил детально Описать морфологию белковыХ зссоцизтов„установить, что хранение не является фзктОром рОстз пзлочкОООрззиых структур и ВыяВить ра наличие зависимости длины о -субъединицы От состава солевого раствора.

7З Ачилоиднзя природа пзлочкообрззных агрегатов О' -субъединиц была красным и нераствОримости В дОдецилсульфате натрия, Впервые показана способностьа"'-субъединицы РНК-поличерззы Е.СО77' к спонтанному образованию амилоидоподобных агрегатов 777 лп О.

Обнаружена фнбРИЛЛЯРНЗЯ форма ЗГРЕГЗТОВ ДИЗМЕТРОМ 5»4 + О, Нч» длниой ДО 300 НЧ И левозакрученной спирзльностью с цгагом Витка — 20 нм. рретьа пекка посааомна»кспернментаиьноьгу иссиедоеаиим методом АСМ червеобразной агрегзции а -субъединицы РНК-полимеразы Е. сой. 7« „ Червеобразные агрегаты, наблюдаемые при сканировании в воздушной среде и в жидкости, имеют форму в виде «бусин на нити».

Измерение высоты и ра~чет величины модуля 1Онгз нз Основе Статис~ического анализа флуктуаций их контуров позволило придти к иключению, что «бусины» образованы более чеч одной молекулой белка н имеют неамилоидную природу, В еетеертод гааее гтредстааеена иерархи гескак модмть агрегм»ии и"'- Субьсдииицы (ЧО»дстн» «КОФЕЙНЫХ ЧЗП7ЕЧЕК»)т ОПИСЫВЗЮШЗя РЗЗЛИЧНЬГЕ стадии формирОВзния Оелковых структурах В Основе мОдели лежит структура СПИРЗЛИ С ОСЬЮ ВРЗШЕНИЯ ТРЕТЬЕГО ПОРЯДКЗ, ПРИ ЗТОМ В уЗЛЗХ СТРА»КТУРЫ находятся димеры белка.

Феноменологическая чодель ооъясняет различие морфолосий !!ало !Кообразных амилоидных фибрилл неамилоидных а!.ре!атоа однопо и топо же белка, о~обенности Образования разветВленных структур и формирование колец на разных стадиях самосборки белка, пути фо1змировання ТОПО или иносо типа набл!Одаемых а!.регатов Оелка.

Модель согласуется с данными измерений пеометрических размеров белковых структур методом АСМ, Важным моментом яв!!Яется Возможно~ть испо~ьзования прелложенйой модели для друпих белко~. К наиболее важным и интересным научным результатам работы можно отнее$'н еледувзФцее." Впервые показана способностью™-субьед!!Ни!!ы РНК-полимеразы Е.сой спон':!анному Образовани!О ам!!'!Оидоподоб!! рх а! р» ! атов щ у!и'о и наиден! ! условия„бз!асопрйятные для выра!Пивания фибрилл и! я!п.о (деления 1-73 и рде Й .

Й р р). П у д б д |д использования амилоидных фибрилл д!!я нужд нанотехнолопии, Разработана Модель амилоиднОЙ а! ре! анин,, которая Обьясняет, ~аким образом формиру!Отея !!ространственйые структуры разли н!ОЙ сложности, позволяет прос!!едить путь От начальных тта!!ОВ образования димеров до более молекулярйосо дизайна, к управленикз пропессом саыоорсанйзапи!! фибрилл пОсредстВом изменения различных физикО-химических факторов. Необходимо отметить системный подход к анализу полученных результатов.

Достоверность полученных в работе результатов Обеспечивается значительным объемоы экспериментальных исследоВаний; испоз!ьзОванием при проведении зксперимен'!ОВ современно!о ~борудования; коррект~ой обработк~Й зкспериментальных данных путем статнстическопо анализа данных и Отсутствием противоречий между ними и теоретическими положениями. 1, Число литературных источников представленных В части обзора, касакзщейся метода ЛСМ 1глава 1, раздел 131, явно недостаточно — список литературы по АСМ о~раничен двумя ссылками на не основополагающие работы иностранных авторов.

Неудивительно поэтому, что приведены избыточные свел~пня о п(юцессе изготовления кремниевых кантилеверов, которые не имеют прямого отношения к теме диссертации, тогда как не Освещены бОлее важные метОдические Особенности рабОты с биологическими объектами в жидкой среде, (например, выбор режимов сканирования, распознавание артефакт~в изооражений и их устранения, аспекты количественных измерении). 2. Неудачны некоторые формулировки: «трехмерная морфология» (морфология — наука 0 форме и строении, которая не мОжет оыть трехме1)ной), «наноразмерное разрешение» «с.5), кадсорбция молекул на поверхности слюды различными сайтами» (с.51).

При дос~а~очно в~соком ~аче~тве оформления работы следует отметить ряд неточностей; не указан масштаб изображения (Рис.1.15; 1.23; 3.1)„размер изображения в каком направлении? (рис.2.3; 2.6; 2.9). Указанные недостатки ни~~ольк~ не снижают общую ценность методологической по своему характеру диссертационной работы, Ко~орал представляет законченное экспериментальное исследование. За)сли)чеиие по диссертации Н.В. Кузьминой. Диссертация изложена ясным физическим языком, выполнена на высоком уровне и представляе* собоЙ завершенное научное исследование на акту'альнук) тему.

Рабов содержит б~л~шое число ори~инал~ны~ экспериментальных данных и иллюстраций, обоснованные решения важных научных и практических проблем, По каждой главе и работе в целом сделаны четкие выводы. Результаты работы„вклк)чая содержание защищаемых поло)кений, в достаточной степени опубликованы в рецензируемых журналах высоким импакт-фактором, апробированы на Всероссийских и МеждунарОдных конференциях. Личный вклад а~тора и его высокая квалификация не вызывак)т сомнения.

Автореферат точно и полно Отражает содержание диссертации. Считаю, что по обьему полученных результатов, их научной и практическОЙ значимости и актуальности диссертация полностью удовле*воряет к))итерияы, установленным В Полол"енин о присужден~и ученых степенен В МосковскОм ГосудзрстВеином университете имени М.В.Ломоносова, з ее автор, Кузьмина Наталья Викторовна, ззслу"кивает присуткленияучепОЙ ~~е~~~и кандидата физико-математических наук по специальностям 03,01.02 - «биофизика» и 03.01.03 - «биоинженерия», 0Й)ицизльный оппОнент И.О, Зав, сектора сканирующей зондоаой микроскопии Федерзльноко посударстаенно) о учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр «Еристзлло) рзф))я и фотоникз» российскоЙ академии наук», ДОКТОР ФИЗИКО-МЗТЕМЗТИЧЕСКИХ НЗУК 1 19333 Москва, Ленинский проспект 59 Рабочий ~еу~ефон ~ЙЯ)5)) 3) 1 ) 00 е )пзй д~~ч )) ч..; - 1 „"::.„)Вя ) ц КЭ.А.

Дьякова .