Отзыв официального оппонента 1 (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli)

официального ошюнснта Лстарова Андрея Викторовича на диссертационную работу Кузьминой Натальи Викторовны «Атомно-силовая микроскопия сигма('70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.сойв на соискание степени кандидата физико-математических наук по специальностям 03,01.02 — биофизика, 03.01.08 — биоинженерия Объектом исследования в диссертационной работе Кузьминой Н.В.

является сигма(70)-субъсдиница РНК-полимеразы Е.сой, белок, необходимый для формирования холофсрмепга РНК-полимсргсзы и инициации транскрипции в бактериальной клетке. Амилоидпая агрегапия сигма(70)-субъединицы, обнаруженная и исследованная соискателем, является редким примером амилоидной аг)х,*гации бактериальных белков. Общность механизмов амилоидной агрсгацни, которая является причиной ряда прионных заболеваний ~ело~с~а. Та~и~ как нсиродегене)зативиыс болезин Альцгеймера, Паркинсона, Хлитинггона, диабцг второго типа и др., делаккг особенно актуальными проведенные в )заботе исследования.

Кроме того„амилоидные фибриллы Ооладают хорощими механическими свойствами, что является привлекательным фактором для их использования в Оиониженсрии. Например, для ~о~дания иапопроволок или пленок. Нс вызываст СОмнения и иаучиая новизна дисссртационгюй работы'. соискателем впервые обнаружена палочкообразная агрегация сигма(70)-субъедииицы РНК-полимсразы Е.сой, из)"чсн полиморфизм агрегатов згого белка, Определены их морфологические и механические характеристики, выявлена роль ))-конца в а|регации.

Наконец, впервые предложена модель, одновременно объяснякзщая два нути агрегации данного белка: амилоидиый и неамилоидный. Эта модель может быть применима и к друз им склонным к полиморфизму агрегатов белкам. Практическая значимость научной работы Исследованные в диссертационной работе механизмы амилоидной гнрегации сигма(70)-субъединицы РНК-полимсразы Есой вносят вклад в понимание механизмов амилоиднОЙ аг)хчзщии в целом. В зависимОсти От сфс)зы потснцивльнОГО применения, такое понимание необходимо как для развития стратегий разрупгсния амнлоидных фпбрилл (зто, безусловно, востребовано в медицине для лечения или предотвращения вызванных амилоидозом заоолсваний), так и.

Наоборот, для стимулирования формирования таких фибрилл (например„для биотехнологий). Одна из задач диссерзиции, как раз, напрямук) связана с выявлением биотехиологически значимых аспектов агрсгации сигма(70)-субъединицы, благоприятствукицих интенсивному формированию агрегатов. Достоверность полученных в работе результатов оосспечивается их высокой воспроизводимосзыо, соотвстствисм )х зультатОН, полученных ргкзличнь|ми методами (таких как атомно-силовая микроскопия„просвечивакицая злсктронная микроскопия, динамическое рассеяние света.

гель-злек-грофорсз и лр.)„в различных средах (как на воздухе, так и в воднь1х растворах), а также согласукицимся с обцн1ми физическими прингипгами поведением харакгеристик белковьгх агрегатов, полученных при различных условиях (таких как ионный состав и ионная сила раствора).

Структура и содержание работы Диссертационная работа Кузьминой Н.В. имеет общепринятую структуру н сосп1ит нз введения. чпгь!Рдх глав, заключения н выводов и списка цитируемой л1ггератур14. Первая глава посвящена литературному обзору, и в нйм рассмотрены вопросы, являющиеся прелметОМ исследоВания диссертации: Описана структура и функции сигмасубьедйниц РНК-полймераз, приведены основные сведения об амилоидной агрегацни, рассмотрены вопросы применения метода атомно-силовой микроскопии (ЛСМ), как основному применяемому методу, к изучению амилоидной агрский белка, Объйм и содержапйе литературно! О обзора пре11ставлякггся хор11ц1О обусловлеййымй содержанйем зкспернментальной части работы.

ВО вто)1ОЙ главе проведен подробный айалйз палочкообразйой агрегацйй сигма(70)-субъеднницы РИК-полимеразы ЕС1н!'. Во-первых, с помощью ЛСМ визуализированы с высоким пространственным разрец!синем палочкообразные агрегаты н продемонстрирована йх сннралызая левозак)1учеййая с!рукгура.

Во-вто)зых, сравнительный ЛСМ-анализ агрегатов белка сигма(70)-субъелйницы, выполненный на разных подложках (слк1да, графит) н в разных средах (воздух и водный раствор) НОдтвсрд31л наличи1". Н1н1очк1юбразных азрегатов й 1юзВОлнл исклк1чить Основанную на аргефакгах интерпретацию ЛСМ-изображений, связанную с высушиваннем образца илй влиянием поверхности какой-то конкретной подложки. Соглащю данным по связыванию с красителем Конго красным, палочкообразные агрегаты имеют амилоидную природу. В- третьих„проведен анализ зависимости плотности адсорбции палочкообразных агрегагов белка в зависимости от концентрации солей в растворе. Эта зависимость позволила сделать выв11д об условиях, благоприятствующих палочкообразной агрегацнн.

Наконец, образование палочкообразных агрегатов было независимо подтверждено с помощью просвеап1ваю1цей зз!Сктронной микроскопии и деполярнзованно1 о динамического рассеяния света. Еще одним вопросом„изложенным во второй главе, является исследование мутантных Видов си!ма(70)-субъединнцы, полностью или частично лишенных )ч-конца. Такое псследованйе было проведено с целью выявления роли )з-конца в агре!'щии и уточнения сй мехаййзма. Результаты ЛОМ-йсследоваййя а1-регатов мутайтйь1х вйдов белка продемонстрировали существенное увеличение агре!ации мутантных сигма(70)- субъедйййц, что позволйло сделать вывод О стаойлйзйрук1щей )золй ))-конца, который предотврщцает интенсивну1о палочкообразнук! агрегапню.

Совокупность представленных ВО второй главе данных свидетельствует о наличии палочкообразной амилоидной агрегацни сигма(70)-субьеднннцы, демонстрирует Особеййостй мехаййзма такоЙ агрегацйн й четко определяет морфоз!Огйческйе особейпостй а!Регатов.

Третья глава посвлцини исследованию червеобразной агре!-анни сигма(70)- суоъедйнйцы. Охаракгсрн1ована структура червеобразных агрегатов„ймею~йх форк1у бусин на нити. Кроме того, определены механические свойства червеобразных агре!азов (такйе как модуль К)нга, пе)1сйстент!щя длййа) й йх завйсймость От йоййОЙ сйлы раствора. Относительно низкие значения модуля РОнга (лежащие в диапазоне 7,8 — 12,3 МПа) позволили соискателю предгюложйть неамнлоидную природу червеобразных агрегатов, В четвертой ! Лаве предложе!щ иерархическая модель ккофсйпых чашек», которая учитывает н объединяет полученные в предыдущих главах диссертащюнной работы 1ксперименгальные результаты. Данная модель подразумевает наличие внутри белка двух "самокомнлсмептарных" участков, обеспечнвакнцих самосборку белка, Лмилонлогенный белок пренс.ивлсн в виде '"кофейной чашки'.

в котором "ручка" и "чаша" соответствуют частично разупорядочеиному участку и структурированноЙ глобуле, соответственно, Согласно да«щой модели, сборка осуществляется либо в виде спнршщ 1что соответствует палочкообразной агрсгацни) либо в внле разветвлдиной цепи 1что соответствует червеобразноЙ агрегацни). ~ри всех присущих работе достоинствах в диссертации имеется ряд недостатков. 71итературный обзор уделяет больп«ое внимание технической стороне атомно-силовой микроскопии„в том числе, например.

техно«щггии изготовления канззп«еве)х«в. В 'го же время более релевантные летали, такие как калибровка размеров н оценка «ффекта расширения обьсктов в плоскости сканирования не освещены совсем. Информация о применениях ЛСМ в биологии в оозоре присутствует. но дана крайне скупо. В исследования «щ мой взгляд ие достаточно ст1«огих доказательств.

исследуемые палочкгк«бразные структуры деиствительио состоят из белка щи ма-70, а ие представлены загрязнением белковой или небелковой природы. Это заюпочение косвенно следует из злекгрофореграмм, котт«рые показываи«т, что в свежлх образцах белок является фактически гомогеиным. В то «ке время, если бы авто)«ы отделили данные агрегаты путем промывки на мембранном концентраторе, подтвердили бы с помощью микроскопии, гго в препарате отсутс.гвуют аморфные агрегаты и„наконец, идентифицировали белок с помощью МЛ 'ь«1грОЕ спектроскопии пептидов, то все сомнения были бы полностью разреп«е««ьь В зкспернменте по связыванию с препаратами белка сигма-70 красителя Конгокраспый также имеется ряд неясностей.

Судя по приведенным спектрам, лишь небольшая часть красителя связалась в белком и претерпела сдвиг максимума поглощения. Для более уверенной интерпретации згих данных не хватает контроля с белком, заведомо пе образу«ощим амилоидных структур 1иап1«име)«, с тем же сигма-70, п1х«пущенным через мембрану 100 КДа), а также с заведомо амилонлным белком, взятом в количестве, сопоставимым с оцененным количеством палочкообразных агрегатов в исследуемом ц1«епарггге. Из описания эксперимента с ДСН-НЛЛГ злектрофорезом не ясно, исследовались лн одни и те же препарать«. или свежиЙ и хранившиЙся препараты были из разных партиЙ. В последнем случае необходимо доказательство воспроизводимости количества агрегатов от выделения к выделению.