Автореферат (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli)

На правах рукописиКузьмина Наталья ВикторовнаАтомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицыРНК-полимеразы E. coliСпециальность 03.01.02 - «Биофизика», 03.01.08 - «Биоинженерия»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква, 2017Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ имениМ.В.ЛомоносоваНаучные руководители:Рууге Энно Куставич, доктор физикоматематических наук, профессор.ДубровинЕвгенийВладимирович,кандидат физико-математических наук.Официальные оппоненты:Толстихина Алла Леонидовна, докторфизико-математических наук, ФГУ ФНИЦ«Кристаллография и фотоника» РАН, и.о.заведующегосекторомсканирующейзондовой микроскопии.Летаров Андрей Викторович, докторбиологическихнаук,институтмикробиологии им.

С.Н. ВиноградскогоРАН, заведующий лабораторией вирусовмикроорганизмов.Батищев Олег Вячеславович, кандидатфизико-математическихнаук,ФГБУНИФХЭ РАН, заместитель директораинститута по научной работе.Защита диссертации состоится «8» июня 2017 года в 14.00 часов на заседаниидиссертационного советаМГУ.01.04 Московского государственногоуниверситета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинскиегоры, д.1, стр. 2, аудитория “ЦФА”.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московскогогосударственного университета имени М.В.Ломоносова и на сайте:https://istina.msu.ru/dissertation_councils/councils/28357490/Автореферат разослан «__» _______ 2017 года.Ученый секретарьдиссертационного совета,кандидат технических наукА.Э. Сидорова2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫРаботапосвященавыявлениюфизико-химическиххарактеристикагрегации σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.

сoli.Актуальность исследованияПроцесс транскрипции в экспрессии генетического материала живыхорганизмов катализируется РНК-полимеразой и характеризуется сложнымвзаимодействием фермента с ДНК и различными белками. Инициациятранскрипции прокариот происходит после присоединения к РНК-полимеразебелка σ-фактора (σ-субъединицы). σ70-субъединица E. coli обеспечиваеттранскрипциюгенов,контролирующихиобслуживающихосновныевнутриклеточные процессы. За последние несколько лет собрано много данныхо структуре и функции σ70-субъединицы, в частности, получены структурыотдельных функциональных доменов.

В некоторых работах упоминается обобразовании агрегатов σ70-субъединицы и ее мутантов, однако без уточненияморфологии и свойств агрегатов.Многие белки склонны к формированию агрегатов, особый интерес средикоторыхвызываютамилоиды.Структурноамилоидыхарактеризуютсябольшим содержанием β-складок, морфологически наиболее часто встречаетсяфибриллярная форма, также отмечаются червеобразные и спиралевидныеструктуры. Кроме этого, характерными признаками амилоидов являютсяспецифическое взаимодействие с красителем Конго красный, вызывающеекрасное смещение в спектре адсорбции с 490 нм на 530-540 нм, специфическоесвязывание с тиофлавином Т и нерастворимость в большинстве растворителей(в частности, в додецилсульфате натрия).

Амилоиды на протяжении уженескольких десятилетий являются предметом разносторонних исследований идискуссий. Наиболее часто встречаемые случаи амилоидной агрегации связаныcзаболеваниямичеловека,такимикакнейродегенеративныеболезниАльцгеймера, Паркинсона, Хантингтона; диабет второго типа и др. Однако впоследние годы стало ясно, что при определенных условиях амилоиднуюформу могут иметь чуть ли не все белки. Хотя амилоиды могут вырасти из3различных по своим функциям и структуре белков, тем не менее, все ониимеют много общего: амилоиды устойчивы к воздействию денатурирующихагентов и протеаз, имеются данные об их способности к самосборке истабильности при высоких температурах (вплоть до 140˚С).

В связи свыдающимися механическими свойствами амилоидных фибрилл предлагаютсяразличныебиоинженерныенаправленияихиспользования:созданиенаноструктурированных пленок с прочностью, сравнимой с прочностью шелка;использование амилоидных фибрилл в качестве ориентирующей матрицы дляорганических солнечных элементов; создание на их основе электрическойнанопроволоки посредством нанесения наночастиц золота и многое другое.Работ по систематическому исследованию агрегации σ70-субъединицыранее не проводилось.

Установление амилоидной природы и описаниеморфологии и свойств агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli и еемутантовпомогутформированияприблизитьсяамилоидныхкпониманиюфибрилл,регуляциипосколькуихпроцессафактическаясамоорганизация контролируется сложным взаимодействием физических ихимических факторов. Механизм агрегации, движущая сила и молекулярныеосновы физических свойств амилоидных фибрилл являются актуальнымизадачами на сегодняшний день, решение которых приведёт к созданию новыхвозможностей для применения в медицине и технологии.Цель и задачи исследованияЦель работы: выявление физико-химических характеристик агрегацииσ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.В этой связи основными задачами работы являлись:1) Исследование морфологии агрегатов белка σ70-субъединицы РНКполимеразы E.

сoli методом атомно-силовой микроскопии и сравнениес данными литературы, касающимися морфологии агрегатов другихбелков.42) Исследование зависимости интенсивности агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. сoli от времени хранения белка и ионной силыраствора.3) Исследование агрегации мутантных вариантов σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli для выяснения роли различных участков белка вагрегации.4) Выявление биотехнологически значимых аспектов агрегации σ70субъединицыРНК-полимеразыE.сoli,благоприятствующихинтенсивному формированию агрегатов.5) Анализмеханическихсвойствчервеобразныхагрегатовσ70-субъединицы РНК-полимеразы E.

сoli.6) Построение модели агрегации σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.сoli.Научная новизна исследования1) Впервые обнаружена амилоидная палочкообразная агрегация σ70субъединицы РНК-полимеразы E. сoli и определены условия,благоприятствующие интенсивному формированию агрегатов.2) Впервые охарактеризованы трёхмерная морфология и физическиесвойства агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.3) Впервые изучено влияние N-концевого участка σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli на её агрегацию.4) Впервые предложенная модель агрегации σ70-субъединицы РНКполимеразы E.

сoli позволяет объяснить полиморфизм образуемыхбелком агрегатов.Методы исследованияЦентральным методом исследования в работе является атомно-силоваямикроскопия.Дополнительноприменялисьнезависимыеметоды:просвечивающая электронная микроскопия, деполяризованное динамическоерассеяние света, электрофорез, спектрометрия, молекулярная динамика.Научная и практическая значимость работы5Амилоиднаяагрегацияσ70-субъединицыРНК-полимеразыE.coli,обнаруженная в бактериальной системе, расширяет класс амилоидогенныхбелков.Определение пространственной структуры амилоидных агрегатов σ70субъединицы и анализ влияния солевого окружения на фибриллообразованиепозволитвыявитьнекоторыеобщиезакономерностиформированияамилоидных структур разных типов белков и их уровней организации иприблизиться к пониманию регуляции этого процесса.

Кроме того, агрегацияσ70-субъединицы может быть связана с регуляцией транскрипции в клетке.Наконец, возможность создания амилоидных фибрилл in vitro на основенетоксичных белков востребована для большого спектра технологическихприложений. В частности, благодаря особым физико-химическим свойствам,амилоидные фибриллы σ70-субъединицы могут быть использованы длясоздания молекулярных архитектур в молекулярной электронике и другихнанобиотехнологических приложениях.Положения, выносимые на защиту1) σ70-субъединица РНК-полимеразы E.

coli способна к спонтанномуобразованию in vitro, в том числе, при условиях, близких кфизиологическим,двухвидовагрегатов:амилоидоподобныхпалочкообразных агрегатов и червеобразных структур.2) Электростатические взаимодействия играют важную роль в агрегацииσ70-субъединицы.3) Разупорядоченные участки N-концевого домена σ70-субъединицыпрепятствуютинтенсивнойагрегациибелка;использованиемутантного варианта белка, частично или полностью лишённого этогоучастка, позволяет значительно улучшить формирование амилоидныхагрегатов.4) С помощью предложенной модели “кофейных чашек” можнообъяснить полиморфизм и пути формирования того или иного типанаблюдаемых агрегатов белка.6Достоверность изложенного в диссертации материала обеспечиваетсяиспользованием широко апробированных подходов и методов.

Результатынаходятся в соответствии с данными, полученными ранее другими авторами.Личный вклад диссертантаАвтор лично проводил анализ литературных данных, участвовал впостановке задач исследования, планировании и проведении экспериментов,получении результатов и выводов, подготовке публикаций и докладов нанаучных конференциях по теме диссертационной работы.Участие автора в исследовании: Подготовка образцов для АСМ-сканирования, получение АСМизображений, их обработка и анализ были проведены автором лично. Данные просвечивающей электронной микроскопии были полученысовместно с Абрамчуком Сергеем Савельевичем, а также КорнеевымДенисом Владимировичем. Анализ данных деполяризованного динамического рассеяния светапроводился совместно с Лаптинской Татьяной Васильевной.Апробация работыМатериалы исследования опубликованы в рецензируемых научныхизданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI (3статьи) и в сборниках тезисов докладов и конференций (9 публикаций).Основные результаты работы доложены на следующих конференциях:Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодыхученых "Ломоносов-2011", Москва, 11-15 апреля 2011; 17-й международныйбиофизический конгресс, Пекин, 30.10-03.11.2011; Ломоносовские чтения,Москва, 14-18 апреля 2014; 7-я международная конференция "Современныедостижения бионаноскопии", Москва, 17-19 июня 2014; 18-й Международныйконгресс по микроскопии, Прага, 7-12 сентября 2014; Международнаяконференция “Super resolution in different dimensions”, Москва, 2-3 июня 2015;Всероссийская научная молодежная конференция “Актуальные проблемы инано- и микроэлектроники”, Уфа, 1-4 декабря 2015; Восьмая международная7конференция “Современные достижения бионаноскопии”, Москва, 15 июня2016.Объём и структура диссертацииДиссертация состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, спискасокращений и списка цитируемой литературы.