Диссертация (Разработка методики и технических средств анализа нанообъектов на примере патогенных микроорганизмов в питьевой воде), страница 4

На основе методов,действие которых основано на ИК-спектрометрии, в России имеет место ряд серийных приборов, специализированных на исследовании состава нефтяных продуктов в водном потоке. Предприятие «Сибэкоприбор», занимающееся выпускомэкологических приборов, производит концентратомер, внесенный под номером№17664-98 в Госреестр РФ. Данное устройство решает задачу измерения молеку-20лярных углеводородов, таких как бензин, дизельное топливо, и т.д.

в воде с пределом обнаружения в концентрациях от 0,02 мг/дм3, точность определяется относительной погрешностью измерений заявленной величиной 0,5%. Контроль почви земельных отложений ограничен концентрациями от 50 мг/кг до 100 г/кг и относительной погрешностью измерений 2%.К сожалению, и метод ПЦР анализа не лишен недостатков: сложная длительная пробоподготовка, дорогостоящее оборудование, специально оборудованные помещения, – не позволяют использовать метод ПЦР для массового экспрессанализа питьевой воды.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный способ, относящийся к разделу молекулярной микробиологии, имеет возмжность обеспечитьрезкого роста незначительных концентраций конкретных заданных участков дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в микробиологическом растворе [9].Мониторинг, основанный на полимеразной цепной реакции, выполняетмногократное избирательное воспроизведение конкретного фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты при помощи участков в лабораторных условиях.

Выполняемое копирование производится для конкретного фрагмента, выполняющегозаданные для копирования условия, лишь в случае, когда имеет место его присутствие в контролируемом растворе (водной среде). При сравнении с амплификацией дезоксирибонуклеиновой кислоты живых организмах, называемой репликацией, при полимеразной цепной реакции амплифицируются значительно меньшиефрагменты ДНК.

В простом ПЦР-процессе величина амплифицируемых ДНКфрагментов по величине ограничивается тремя тысячами пар оснований. Применение смесей разнородных полимераз и внесении добавок, соблюдая регламентированные условия проведения ПЦР-реакции величина фрагмента способна увеличиться до 30 тысяч пар нуклеотидов. Для выполнения полимеразной цепной реакции в нормальных условиях следует задаваться следующим набором необходимых для использования компонентов:матрица, ДНК-содержащая амплифицируемый фрагмент.21Несколько праймеров, которые были бы комплементарно противоположныхвостам отличных участков реплицируемых ДНК.Питательный состав, поддерживающий требуемые параметры реакции, такие как величина рН, ионную мощность состава и т.д.

Может иметь в составе некоторые соли и сывороточный альбумин.Во избежание испарения смеси в реакторе в кювету с образцом вносят вы-сотемпературное масло. При применении амплификатора с термостатическойкрышкой добавку вносить не рекомендуется.Внесение в процесс пирофосфатазы имеет возможность повысить количество продукта полимеразной цепной реакции. Данный фермент имеет каталитические свойства для процедуры гидролиза пирофосфата, как побочного продуктадобавления нуклеотидтрифосфатов в увеличивающемся фрагменте ДНК.На практике при процедуре полимеразной цепной реакции проводится от 20до 35 повторений, каждое в свою очередь должно состоять по меньшей мере трехосновных стадий.Для репликации матричной цепи полимеразой дезоксирибонуклеиновойкислоты применяется затравочный праймер, данная процедура именуется стадиейэлонгации.

Температура данного процесса зависит от полимеразы. Большинствораспространенных полимераз протекают активнее при температуре 72 °C. Длительность процесса элонгации зависит от величины амплифицируемого участка.Также процесс зависит и от типа ДНК-полимеразы. При расчете чаще всего длительность элонгации задают около одной минуты исходя из количества тысяч пароснований. В завершении всей процедуры выполняют еще одну стадию финишной элонгации для того, чтобы завершить выстраивание полных одноцепочечныхучастков.

Данная операция суммарно занимает 7-10 мин.Диагностику наличия того или другого агента проводят с помощью люминесцентного метода. Распознается люминесценция непосредственно биообъектаили входящих в его состав элементов, существует возможность использовать вариацию линии люминесценции при внесении в состав раствора определенных реагентов (подобный подход реализован при проведении иммуноанализа и ПЦР).22Процесс люминесценции включает в себя переход молекул на возбужденныйэлектронный уровень, колебательную релаксацию в возбужденном состоянии, переход на основной электронный уровень либо с испусканием света (собственнолюминесцентное излучение), либо безызлучательной и колебательной релаксациив основном состоянии.Методы активной лазерной спектроскопии.

В настоящее время активноразвиваются методы, основанные не на линейности связи входных и выходныххарактеристик, а на анализе особенностей спектров, полученных при выборе в качестве источника излучения для контроля параметров раствора лазера и анализеспектральных характеристик, полученных при прохождении или отражении отисследуемой среды [63, 74, 94]. К этим методам относятся: лазерный метод ИКспектроскопии, методы комбинационного (Рамановского) рассеяния [110] и методВРМБ (вынужденного рассеяния Мандельштама-Бриллюэна). Достоинства этихметодов – очень высокая точность, возможность проводить анализ практическидля любых малых концентраций, вплоть до наноконцентраций [85].

При этом погрешность данного метода может достигать 0,1-0,5%.Известны математические методы разложения общей спектральной картинки на отдельные максимумы, которые по определенным параметрам позволяют диагностировать не только наличие вещества, но его концентрацию. Это позволяет выделять информацию о концентрации сразу нескольких объектов, используя только одно измерение.К недостаткам можно отнести высокую стоимость, вследствие использования прецизионного оборудования (лазеров и спектроанализаторов с высоким разрешением). Однако при контроле большого количества параметров, контрольданными методами становится дешевле, чем автоматизированная линия, состоящая из разных приборов. Помимо этого они во многих случаях не нуждаются всамом дорогостоящем аппаратурном резервировании.

Для пояснения последнегоположения необходимо рассмотреть принцип каждого метода подробнее.Позитивным свойством ИК-спектроскопии можно выделить детерминированность линий поглощения для вещества конкретной атомной группы, то есть23присутствующего для всей группы в некотором конкретном интервале ИКспектра, что позволяет контролировать концентрации большого количества веществ в однократном измерении при использовании широкополосного анализатора оптических спектров.Погрешность количественного анализа, как правило, составляет тысячныепроценты массовой доли растворенного вещества.Метод ИК-спектроскопии.

Данный способ базируется на изучении спектральных показателей поглощения и отражения лазерного излучения в ИКобласти, то есть выходом в интервал длин волн от 10-6 до 10-3 м, причем спектр винфракрасной области излучения характеризуется особой сложностью кривой,содержащих множество локальных максимумов и минимумов.Линии поглощения возникают вследствие квантовых переходов с низшихколебательных уровней на метастабильный уровень электронного состояния водной среды. Характеристика полученных спектров (положения максимумов лоренцевых линий, соответствующая полуширина и относительная интенсивность) индивидуальной компоненты зависят как от масс составляющих атомов, так и отгеометрии строения, функции распределения заряда и др.

В связи с данным обстоятельством инфракрасные спектры имеют высокую индивидуальность, определяющую их значимость для исследований.Зависимость интенсивности I рассеянного водной средой излучения и интенсивностью возбуждающего света I0 от значений параметров поглощения средой в данном методе основана на законе Бугера-Ламберта-Бера, следовательно накорреляции интенсивности линий поглощения от величины концентрации примеси в составе раствора. В данном случае концентрация примеси вычисляется не пофактическим линиям поглощения, а по характеристикам функции распределенияспектра в общем для увеличенного интервала исследуемых длин волн.

Погрешность количественной оценки параметра не превышает 1 процента.Метод ИК-спектроскопии представляется унифицированным физикохимическим способом анализа структурных свойств как неорганических, так иорганических соединений, в том числе биоорганических [26, 71]. Мониторинг ба-24зируется на явлении поглощения рядом молекул исследуемого раствора инфракрасного электромагнитного фронта. Поглощение вызвано возбуждением атомарных колебаний квантами возбуждающего инфракрасного спектра.

При воздействии на атомы и молекулы возбуждающего света поглощаются лишь те порциисвета, которые соответствуют частотам деформационных, либрационных и валентных колебаний атомов и соединений.Распознавание неисследованных раннее веществ данным методом требуетиспользование сложных вычислительных систем, основанных на теории распознавания и нейронных сетях. Данные математические модели на основе обнаруженных корреляций воссоздают структуры молекул, после чего выстраивают теоретические кривые на основе полученных данных и сличительным способомопределяют достоверность полученных результатов. Исследование строения молекул и объектов микробиологии методом инфракрасной спектроскопии позволяет говорить об вычислении параметров молекулярных моделей для решения обратных спектральных задач.

Решение подобных задач может позволить последовательным приближением откалибровать настроечные аргументы модели.Входными данными биомолекулярных моделей являются массы компонентов, входящих в структуры атомов, дистанции связей, валентность и свойствапотенциальной плоскости, производные дипольных моментов связей по расстоянию и т.д.