практика по цитологии (1) (Отчет по практике - Исследование морфологических параметров качества доимплантационных эмбрионов)

Новосибирский государственный университетФакультет естественных наукКафедра цитологии и генетикиОтчет по учебной практике, практике по получению первичныхпрофессиональных умений и навыков, по цитологии:“Исследование морфологических параметров качествадоимплантационных эмбрионов”Выполнил:студент 19404 группыМ.О. БоброваРуководитель:д.б.н.

ИЦиГ СО РАНГерлинская Людмила АлексеевнаОценка: отличноНовосибирск, 2021ВведениеВсе более широкое распространение вспомогательных репродуктивныхтехнологий, включающих этап экстракорпорального оплодотворения, влияет наздоровье новых поколений.Несмотря на молодость людей, появившихся благодаря процедуре ЭКО,некоторые эпидемиологические исследования отмечают в этой группе людейболее высокий, чем в контрольной, риск диабета, нарушений обмена веществ,артериальной гипертензии, нейропсихических расстройств.

Эти результатыпозволяют сделать прогнозы о более быстром развитии возрастных патологий,которое в ближайшем будущем вырастет в реальную проблемуздравоохранения [5-7].Так как к процедуре ЭКО прибегают не только пары, не имеющие возможностьзачать ребенка самостоятельно, но и люди, имеющие различные отклоненияздоровья: избыточный вес, нарушения психоэмоционального статуса и другиезаболевания, становится трудно дифференцировать вклад в потенциальныенарушения здоровья самой процедуры ЭКО и генетических и физиологическихособенностей родителей [8].Тем не менее, приведенные выше факты не останавливают развитие сферыВРТ.

Фертилизация in vitro широко используется как технология тиражированиивысокопродуктивных сельскохозяйственных животных. По оценкамамериканских животноводов, начиная с 2014 г, для воспроизводства крупногорогатого скота используют практически равное число эмбрионов, полученных invivo и in vitro. За 40 лет после первой удачной беременности путем ЭКО, числолюдей, рожденных после этой процедуры, превысило 10 миллионов [4].Прогнозируется неизбежное расширение применения вспомогательныхрепродуктивных технологий как в клинической практике, так и вживотноводстве.Необходимо отметить, что помимо потенциальных проблем со здоровьемпотомков, фертилизация in vitro предоставляет возможности для профилактикизаболеваний путем воздействия на эмбрион прямо с первых минут его жизни.Эта возможность предоставляет развитие новых инвазивных и неинвазивныхтехнологий. В последние годы все большее распространение получаюттехнологии “one cell sequence”, которые позволяют на самом раннем этаперазвития выявить генетические нарушения.

Неинвазивные технологииtime-lapse скрининга развития эмбрионов от стадии фертилизации добластоцисты позволяют с помощью морфологических критериев ранжироватьin vitro развивающиеся эмбрионы по морфологическим признакам.Фенотипические последствия ЭКО и ВРТ могут быть наиболее эффективноопределены в контролируемых экспериментах на лабораторных животныхвысокого качества.Для проведения подсадки эмбрионов необходимо оценивать их качество.Разработанные в настоящее время морфологические критерии оценки качестваэмбрионов плохо коррелируют с их жизнеспособностью после подсадкиматери.

Поэтому существует необходимость усовершенствования подходов коценке качества и разработки новых критериев.В ходе моей учебной практики исследования выполнялись на базе Центрагенетических ресурсов лабораторных животных ФИЦ ИЦиГ СО РАН,которыйобеспечивает содержание подопытных животных согласно мировымстандартами качества, включающим в себя: генетическое соответствиеисследуемых линий, отсутствие видоспецифических патогенов (specificpathogen free – SPF). Основными объектами исследования послужили мышиаутбредной линии CD1, которые отличаются от других линий высокимидоимплантационными потерями эмбрионов , что указывает на ихвосприимчивость к вариациям условий развития на стадии от фертилизации добластоцисты [3].Цель работы: исследовать морфологические параметры качествадоимплантационных эмбрионовЗадачи:-обучение проведению процедуры суперовуляции-обучение проведению процедуры in vitro фертилизации (ЭКО)-оценивание качества эмбрионов по морфологическим признакам припомощи time-lapse микроскопииМатериалы и методыМетоды: протокол ЭКО:1)Приготовление чашки петри с питательной средой либо за 24 часа, либо за 30минут до процедуры.

Чашки:● для сперматозоидов: 2 капли питательной среды HTF(раствор,имитирующий среду внутри маточных труб): 120 мкл и 90 мкл● для ооцитов 1 капля HTF 90 мклСверху капли покрываются минеральным маслом (3.5-4 мкл)2)Приготовление рабочего места: инструменты, салфетки, смоченные водой,пакет для трупов мышей.3)Приготовление чашки для сперматозоидов, далее забивание самца,извлечение семенников, помещение их в каплю 120 мкл, произведениенадрезов микропинцетом.

Чашка со сперматозоидами ставится на 30 минут винкубатор4)Приготовление чашки для яичников. Забивание самки, Врезание яичников ипомещение их в минеральное масло на край чашки на дно. Извлечение изкаждого яичника кумулюс с ооцитом путем надреза ампулы. Чашка с ооцитамиоставляется на 30 минут в инкубаторе.5)По прошествии 30 минут из чашки со сперматозоидом из капли 120 мкл с еекрая извлекается 10 мкл наиболее активных сперматозоидов при помощимикропипетки; и переносится в каплю 90 мкл. После этого чашка оставляетсяна 30 минут в инкубаторе.6)Трупы мышей убираются в морозильную камеру.7)Через 30 минут из инкубатора извлекаются обе чашки.

Из капли 90 мкл сосперматозидами берется 10 мкл с края капли и переносится в каплю сооцитами. Чашка оставляется в инкубаторе на 4-6 часов.8)Через 4-6 часов производится промывка зиготы путем переноса из капли вкаплю объемом 60 мкл.Материалы:- культуральные среды KSOM и HTF- микроскоп Olympus SZX10- автоматический микроскоп Lionheart FX (Biotek)- СО2-инкубаторы N-BiotekВ микроскопе Lionheart FX используется система time-lapse. Она позволяетполучать изображения эмбрионов через регулярные интервалы времени втечение всего периода их развития, то есть с момента оплодотворения и домомента переноса эмбрионов в полость матки.

Главное преимущество такогомикроскопа в том, что он является объединением биологического инкубатора ссистемой микроскопического наблюдения и фотографии, что позволяетосуществлять инкубацию эмбрионов в оптимальных условиях, безнеобходимости извлекать их из инкубатора для осмотра, в связи с чем удаетсяизбежать изменения условий их созревания и становится возможнымосуществление постоянного контроля за их развитием, как с точки зренияизучения их конкретных морфологических характеристик, так и динамическихкритериев роста и созревания [2].РезультатыВ ходе практики я освоила метод неинвазивной оценки эмбрионов - методtime-lapse микроскопии и ознакомилась с различными системамиморфологической оценки эмбрионов.Изучение 20 эмбрионов проводилось в течение 66 часов при помощи системыtime-lapse микроскопии в микроскопе Lionheart FX.

Интервал между фото- 2часа. Эмбрионы помещали в микроскоп спустя 6 часов после внесения спермык яйцеклеткам. Увеличение объектива — Х20. Эмбрионы выращивались достадии морулы.Зиготы мышей линии CD1 спустя 4-6 часов после оплодотворения:рис. 1Ниже будут приведены результаты исследования для эмбрионов,морфологические признаки которых являются наиболее показательными.Иллюстрация развития эмбриона №2 мыши линии CD1 с 0 до 30 часов:рис. 2Иллюстрация развития эмбриона № 9 мыши линии CD1 с 0 до 66 часов:рис.

3Иллюстрация развития эмбриона №5 мыши линии CD1 с 0 до 66 часов:рис. 4В ходе практики я опиралась на принятые в настоящее время иразрабатываемые в SPF-виварии оценки качества эмбрионов с помощьюtime-lapse микроскопии.Используемые критерии:1)толщина zona pellucidaна примере зигот (рис.1) хорошо видно, что ширина zona pellucida варьирует.

Вкачестве примера нормальной толщины zona pellucida можно привести зиготу 1.Зигота 2 имеет аномальную толщину zona pellucida. Помимо методовнаблюдения и оценки эмбрионов я также освоила методику проведениясуперовуляции у мышей и процедуры проведения in vitro фертилизации.2)грануляцияНа примере эмбриона 2(рис. 2), хорошо видна полная грануляция.3)синхронность деленияна примере 3 эмбриона можно наблюдать асинхронное деление. У него приасинхронном делении через 64 часа произошло ускорение делениябластомеров.Эмбрион 9, представленный на рисунке 3, успешно развился до стадииморулы.Также в ходе практики я освоила методы проведения процедуры суперовуляциии in vitro фертилизации.Обсуждение результатовОценка качества зигот:Для расчета влияния толщины zona pellucida на вероятность беременностииспользуется формула:[1].Чем больше коэффициент Zvar, тем больше вероятность беременности.Можно сделать прогноз, что клетки со слишком толстой zona pellucida(например, зигота 2) не приведут к успешной беременности, как и со слишкомтонкой.

Можно сделать прогноз,что такая зигота не приведет к развитию“хорошего” эмбриона.Оценка качества эмбрионов:Эмбрион под номером 2 (рис. 2) имеет низкий потенциал развития. Грануляциясвидетельствует о начальной стадии апоптоза беременности.Эмбрион под номером 5 (рис. 3), демонстрирующий асинхронный тип деления,можно отнести к числу эмбрионов с риском неблагоприятного исхода.Эмбрион под номером 9 (рис.

4), делящийся синхронно, можно отнести к числуперспективных при дальнейшем развитии.ВыводыМетоды оценки эмбрионов в большинстве случает позволяют эффективнооценить качество эмбриона - возможность имплантации, появлениябеременности.Time-lapse микроскопия является важным инструментом временногосодержания, наблюдения и скрининга эмбрионов.Оценка морфологии эмбрионов не всегда идентична конечным результатам.Другими словами, может случиться так, что трансфер самых лучших сморфологической точки зрения эмбрионов не приведет к получениюбеременности, а внедрение эмбрионов более слабой морфологии приведет, вконце концов, к рождению здорового потомства.Список литературы1) Bączkowski T., Kurzawa R., Głąbowski W.