1631210422-972e26bf3b24afe5e58bdf1a7ac3dbe3 (Лекция 7 - Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов), страница 3

Олигомеры НОНАрасширяют арсенал научных методов конструирования синтетическихнуклеиновых кислот как возможных лекарственных препаратов нового поколения исредств медицинской диагностики.Нона – это не только сравнительно нечасто встречающееся в нашей стране женскоеимя. В древнеримской мифологии Ноной звали одну из трех сестер Парок, богиньсудьбы. Римляне считали, что власти Парок покорны не только люди, но и самибоги. Старшая, Нона, выпрядала нить жизни человека, Децима отмерялаотпущенный судьбой срок, а младшая, Морта, ножницами перерезала нить,обрывая жизнь в предопределенный судьбой момент. В приложении к новымолигонуклеотидам – основы для перспективных лекарственных препаратов,название НОНА звучит особенно символично, если вспомнить, что ближайшиманалогом нити жизни может служить именно нитевидная молекула ДНК.Интересным является еще одно «приложение» этого названия: НОНА – такое имябыло дано универсальной артиллерийской системе, совмещающей в себе функциипушки, гаубицы и миномета.

Предположительно, это название являетсяаббревиатурным сокращением от «нового орудия наземной артиллерии». Не правдали, весьма символично, если учесть, что новые соединения могут статьэффективными и «прицельными» препаратами в нашей извечной борьбе снедугами?Морфолиновые аналоги олигонуклеотидовДиметиламидофосфатныеморфолиновыемодификации(Phosphorodiaminoamidatemorpholino modifications, PMO) – этосоединения, в которых прошла двойнаязамена – пентозы на остаток морфолина инемостиковогокислороданадиметиламиногруппу.Такиеполимерыэлектронейтральны, показывают хорошеесвязывание с ДНК и РНК, полностьюустойчивы к действиям нуклеаз, имеютменьшуютоксичностьибольшуюспецифичность,чемолигомерыстиофосфатной модификацией. Хотя в нихтакже имеется дополнительный хиральныйатом фосфора, вследствие чего олигомерытакого типа представляют рацемическуюсмесь 2n диастереомеров, где n – числофосфатных групп.

В настоящее времянекоторые антисмысловые морфолиновыеаналоги проходят клинические испытания.Морфолиновые аналоги олигонуклеотидовСинтез морфолиновых нуклеозидов заключается взамене рибозного кольца на морфолиновое врезультатепоследовательностипревращений:окисления 2',3'- вицинальных гидроксилов рибозы,замыканиядиоксиморфолиновогоциклаипоследующего восстановления.Фосфорилирующий реагент, используемый дляполучения мономерного синтона, также отличается отприменяемого в стандартном амидофосфитном методесинтеза. Синтетический цикл включает стадиидетритилированияиконденсацииспродолжительными промежуточными промывками.Образование связи между мономерными звеньямипроисходит в результате реакции нуклеофильногозамещения хлорид аниона деблокированным атомомN морфолиниевого кольца.Нижепредставленаструктураморфолиниевой полинуклеотидной цепи.Синтез активированного морфолинового мономераHOOHOB+OH OHCHBn+1OCH2 OPOOPNN(CH3)2CH2 OPN(CH3)2NHOHN(CH3)2HOOTrOBвосст.NOHOClONCHOOONH3IO4фрагментаBnO_HOBBONHBПептидо-нуклеиновые кислоты(ПНК, peptide nucleic acids, PNAs)Многообещающими аналогамиолигонуклеотидов являются полимеры,построенные из мономеров, соединенныхпептидными связями.

Пептидо-нуклеиновыекислоты (ПНК, peptide nucleic acids, PNAs)были введены в олигонуклеотиднуюпрактику Питером Нельсоном (P.E. Nielsen,M. Egholm, R.H. Berg and O. Buchardt.Sequence-selective recognition of DNA bystrand displacement with thymidine-substitutedpolyamide. Science, 1991, 5037, 1497-1500).Они имеют природные гетероциклическиеоснования, присоединенные кпептидоподобному остову, который состоитиз мономеров 2- аминоэтилглицина. Врезультате ПНК электронейтральны, но приэтом обладают свойством образовыватьпрочные дуплексы с природными ДНК иРНК.Синтез пептидных аналогов олигонуклеотидов (ПНК или PNA – peptide nucleic acids)ПНК синтезируют твердофазным методом, аналогичным синтезупептидов с использованием защищенных мономеров.

Мономерыдля таких аналогов нуклеиновых кислот получаюталкилированием гетероциклических оснований галогенуксуснойкислотой по атомам N1 пиримидиновых или N9 пуриновыхгетероциклов. Конденсация проходит аналогично твердофазномупептидному синтезу с образованием амидной связи (о нем мыбудем говорить позже). Аминогруппа аминоэтильного фрагментаблокирована временной защитой, удаляемой перед каждойстадией конденсации.

Временные защиты мы также будемрассматривать позже в рамках темы «Химический синтезпептидов). Экзоциклические аминофункции гетероциклическихоснований защищаются бензгидрилоксикарбонильными (Bhoc)группами, которые отщепляются водным растворомтрифторуксусной кислоты.ПНК плохо растворяются в воде. Для улучшения растворимостив биополимер, как правило на концы, вводят положительнозаряженные аминокислоты, например, лизин.

После завершениясинтеза ПНК можно продолжить синтез ДНК, для чего в качествелинкера вводится гидроксилсодержащая молекула. Такимобразом, можно получать ДНК-ПНК-конъюгаты. Такиесоединения легче проникают в клетку, чем отрицательнозаряженные нуклеиновые кислоты.OOCH 3CH 3NHNH+NHH al-C H 2 -CO O HNOC H 2 -C O O HDCC+OCH 3NHNOCH 2СOZ-N H -C H 2 -C H 2 -N -C H 2 -C O O HOZ-N H -CH 2 -C H 2 -N H -C H 2 -C O O HКОВАЛЕНТНО ЗАМКНУТЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (LOCKED NUCLEIC ACIDS, LNA)Ковалентно замкнутые нуклеиновые кислоты (locked nucleicacids, LNA) были впервые описаны Такеши Иманиши иДжеспером Венгелем (S. Obika, D.

Nanbu, Y. Hari, K. Morio, T.Imanishi. Synthesis of 2'-O4'-C-methylenuridine and - cytidin. Novelbicyclic nucleosides having a fixed C-3',-endo sugar puckering.Tetrahedron Lett., 1997, 38, 8735-8738; S.K. Singh, P. Nielsen, A.A.Koshkin and J. Wengel, LNA (locked nucleic acids): synthesis andhigh affinity nucleic acid recognition.

J. Chem. Soc. Chem. Commun.,1998, 455-456). LNA имеют метиленовый мостик между 2'кислородом и С4'-углеродом углеводного фрагмента, в результатечего закрепляется 3'-эндо конформация сахара, уменьшаетсяконформационная подвижность рибозы и повышается локальнаяорганизация углеводо-фосфатного остова, что приводит кобразованию более прочных дуплексов с ДНК и РНК.Синтез LNA-олигонуклеотидовПри рассмотрении этой темы, в вас долженпроснуться органик. Ковалентно замкнутыенуклеозиды получают из бис-изопропилиденовогопроизводного D-аллозы. Внимательно изучитесхему синтеза и дайте ответ: «Из какогосоединения синтезируют бисизопропилиденовое производное D-аллозы?»Синтез LNA-олигонуклеотидовOHOHCH2OOКлючевой стадией является конденсациясоответствующим образом защищенногоацетилгликозида и ацилированного поэкзоциклической аминогруппегетероциклического основания.

Реакциягликозилирования предшествуетзамыканию цикла между 2'-кислородом иС4'- метиленовой группой.NaOHOOBnOOOBnHOOMsClMsOMsOOCH3OAcOAcMsOOOHOMsOBBOONaOHOOBnMsOOBnOAcH2PdTMSOTfDMTrOBHOBOOMSClOOBnHBBSA,TMSOTfCH3HH3C C N Si CH3HCH3OAc2OOBnMsOH3C Si CH3BCA =ONCSHCCl3OOO P NOOOHOОбласти применения олигонуклеотидов и их аналоговВ наши дни разработкой и синтезом олигонуклеотидов и их аналогов занимается большойисследовательский и индустриальный сектор экономики.

Рынок олигонуклеотидов только дляисследовательских целей в 2013 г. превысил 700 млн долл. Уже синтезированы десятки новых видовхимически модифицированных олигонуклеотидов; созданный на их основе ряд противовирусных ипротивовоспалительных препаратов проходит клинические испытания, а некоторые из них ужеиспользуются в медицинской практике.Например, препарат витравин, созданный компанией «ISIS Pharmaceuticals» (США), применяют длялечения больных цитомегаловирусным ретинитом – это поражение глаз возникает при значительномослаблении иммунной системы в результате заболевания СПИДом, химиотерапии, трансплантации илиприема иммуносупрессоров. Препарат представляет собой химически модифицированныйолигонуклеотид (тио-ДНК), комплементарный одной из мРНК цитомегаловируса.

В начале 2013 г.компания вывела на рынок еще один препарат из этого семейства – кинамро, предназначенный дляснижения уровня липопротеидов низкой плотности у больных гомозиготной семейнойгиперхолестеринемией, редкого, но очень тяжелого заболевания сосудистой системы.Одним из мировых лидеров в развитии терапии на основе малых интерферирующих РНК являетсякомпания «Alnylam Pharmaceuticals» (США). Созданный там препарат патисиран предназначен длялечения группы тяжелых наследственных заболеваний, связанных с дефектами гена, кодирующего белоктранстиретин. Накопление мутантного белка приводит к развитию тяжелых нейропатий икардиомиопатий, которыми в мире страдают сотни тысяч человек.