1631210422-972e26bf3b24afe5e58bdf1a7ac3dbe3 (Лекция 7 - Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов), страница 2

Конденсация приводит к образованию Н-фосфонатдиэфирной связи, которые достаточно стабильны и могутподвергаться окислению до фосфата не постадийно, как вфосфитамидном методе, а после завершения образованияполинуклеотидной цепи.3) Стадия окисления заменяется реакцией сульфурирования, чтоприводит к образованию тиоаналогов олигонуклеотидов. Кэпированиепроводится после сульфурирования.3-(Диметиламинометилиденамино)-3H-1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT)обеспечивает высокую скорость сульфурирования и обладаетстабильностью в растворе.

Реагент Бокажа (Beaucage Reagent) имеетболее высокую растворимость в ацетонитриле и обеспечиваетпротекание реакции за более короткое время. Однако, он имеетограниченную стабильность в растворе и менее эффективен присульфурировании связей РНК.1)8Н-фосфонатный метод синтеза фосфорамидов олигонуклеотидовОкисление Н-фосфоната (соединение 10) в присутствиипервичного амина, например, цистаминаприводит кобразованию фосфорамида (соединение 10). Это обеспечиваетвозможность вводить по сахаро-фосфатному остову различныефункциональныегруппы,например,сульфгидрильные(соединение 3).

Путем последующего алкилированиясульфгидрильныхгруппсинтезировали,например,производное олигонуклеотида с группировкой, способной кхелатированию ионов металла (на рис. соединение 1).Хелатирование ионов меди, например, приводит к получениюсоединений, способных генерировать свободные радикалы,разрушающие ДНК.Присоединение химической реакционноспособной группы к олигонуклеотидупревращает его в препарат направленного действия. За счетолигонуклеотидной части структуры он избирательно связываетсяс определенным участком нуклеиновой кислоты, а присоединеннаяхимическая группа, в зависимости от ее природы, отвечает за разрушениеэтой нуклеиновой кислоты или за внесение в нее химического изменения.Далее речь пойдет о фосфорилгуанидиниевых аналогах олигонуклеотидов.

У известныхсерусодержащих аналогов нуклеиновых кислот – тиофосфатов – на месте фосфатных групп стоятотрицательно заряженные тиофосфатные, а у фосфорилгуанидинов – незаряженныефосфорилгуанидиновые группыВ чем же состоит сходство и различие междуобычными нуклеиновыми кислотами ифосфорилгуанидиновымианалогаминуклеиновых кислотами (см. структуру I)?Обычная молекула ДНК или РНК включает всебя отрицательно заряженные фосфатныегруппы (PO2–), соединяющие между собойсоседние нуклеотиды.

У аналогов же ДНК,впервые полученных в ИХБФМ СО РАН,местофосфатныхгруппзанимаютнезаряженныефосфорилгуанидиновыегруппировки.Низкомолекулярныехимические соединения подобной структурывстречаются в живой природе и быливпервые синтезированы (кстати, тожеотечественными химиками) еще в 1960-е гг.(Алимов,Левкова,1964).Однакомакромолекулынаосновефосфорилгуанидинов,вчастности,производные ДНК или РНК, до сих порполучены не были, и свойства их оставалисьнеизвестными.Фосфорилгуанидины.

Новый класс аналогов нуклеиновых кислотСерусодержащие производные, выражаясь языкомхимиков, при этом проявляют меньшее «желание»(сродство) к образованию комплементарного комплекса снуклеиновыми кислотами-мишенями. Другими словами,образующиеся в этом случае двойные спирали менееустойчивы, чем такая же по числу нуклеотидов обычнаядвойная спираль ДНК.

Химики связывают это явление сбольшим, по сравнению с атомом кислорода, радиусоматома серы.Зато выяснилось, что фосфорилгуанидиновые двойныеспирали весьма мало отличаются по стабильности отприродной двуцепочечной ДНК. Этот результат можносчесть удивительным, если сравнить размерыфосфорилгуанидиновой группы с размерами атомовсеры и кислорода. Поразительно, нофосфорилгуанидиновая группа, несмотря на свойзначительный размер, в целом неплохо вписывается впараметры двойной спирали ДНК, не вызываясущественного возмущения ее структуры.

Средимножества известных на сегодняшний день химическихмодификаций фосфатной группыфосфорилгуанидиновая группировка представляетсобой, пожалуй, уникальное явление.Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислотНо зачем нам замещать в ДНК отрицательно заряженные фосфаты незаряженнымигруппами? Здесь нужно снова вернуться к природным олигонуклеотидам –относительно коротким цепочкам нуклеиновых кислот, производные которыхновосибирские исследователи полвека назад предложили использовать в качестве геннаправленных лекарственных препаратов.Во-первых, известно, что при попадании в живой организм обычные олигонуклеотидыбыстро распознаются и атакуются ферментами, в результате чего распадаются насоставляющие звенья за считанные минуты. Поэтому лекарственные средства наоснове нуклеиновых кислот должны быть устойчивы к действию ферментов. Вовторых, чтобы попасть внутрь живой клетки, олигонуклеотиды должны миноватьбарьер – клеточную мембрану, состоящую преимущественно из липидов.

И здесьотрицательный заряд нуклеиновых кислот является скорее помехой, посколькунезаряженным химическим соединениям было бы проще взаимодействовать снеполярными липидными молекулами, составляющими клеточную мембрану.Так как новые фосфорилгуанидиновые аналоги нуклеиновых кислот не несутотрицательного заряда, то, теоретически, им должно быть проще проникнуть сквозьмембрану в клетку. Что касается их устойчивости к действию ферментов, то и здесь уновых олигомеров все в порядке.Известно, что в организме за расщепление нуклеиновых кислот отвечают ферментынуклеазы. Новые аналоги нуклеиновых кислот сначала прошли испытание наустойчивость к действию одной из наиболее активных нуклеаз – фосфодиэстеразызмеиного яда.

Оказалось, что включения в состав олигонуклеотида однойединственной фосфорилгуанидиновой группы достаточно, чтобы затормозить егорасщепление более чем на час, в то время как природный олигонуклеотид полностьюрасщеплялся менее чем за пять минут. Позднее выяснилось, что олигонуклеотиды, вкоторых фосфатные группы полностью замещены фосфорилгуанидиновыми,остаются неизменными в среде с высоким содержанием сыворотки в течение какминимум трех суток.Растворимость в воде у фосфорилгуанидинов, несмотря на их нейтральный характер,достаточно хорошая, что опять-таки немаловажно для лекарственных препаратов.Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислотНовый класс аналогов нуклеиновых кислот,содержащих фосфорилгуанидиновую группу.Окисление связанного с полимерным носителемдинуклеозид-β-цианэтилфосфита йодом в присутствии1,1,3,3-тетраметилгуанидина приводит к образованиюдинуклеотида, содержащего незаряженнуютетраметилфосфорилгуанидиновую группу (Tmg), вкачестве основного продукта.

Tmg-группа устойчива вусловиях твердофазного олигонуклеотидного синтеза,последующего удаления защитных групп и отщепленияолигонуклеотида от полимерного носителяаммонолизом.Олигонуклеотиды, содержащие Tmg-группу, способнысвязываться с комплементарнымипоследовательностями ДНК и РНК со сродством, лишьнезначительно отличающимся от сродства природныхолигодезоксирибонуклеотидов.Фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидов.

Амидофосфитный подход к синтезу.Фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидовсинтезируют с помощью фосфитного триэфирногометода.Окисление связанного с полимернымносителем динуклеозид-β-цианэтилфосфита йодом вприсутствии 1,1,3,3-тетраметилгуанидина приводит кобразованиюдинуклеотида,содержащегонезаряженнуютетраметилфосфорилгуанидиновуюгруппу (Tmg), в качестве основного продукта. Tmgгруппа устойчива в условиях твердофазногоолигонуклеотидного синтеза, последующего удалениязащитных групп и отщепления олигонуклеотида отполимерного носителя аммонолизом.После отщепления от полимерного носителя 25%воднымрастворомаммиака,олигонуклеотидвыделяют методом ВЭЖХ на колонке с обращеннойфазой. На профиле элюции реакционной смеси,приеденном качестве примера, видно, что основнымпродуктом является фосфорилгуанидиновый аналоголигонуклеотида(краснаялиния).Модифицированному олигонуклеотиду соответствуетдва пика, которые можно отнести к отдельнымдиастереомерамвсилухиральностимежнуклеотидной фосфоилгуанидиниевой группы..Фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидов для медициныМышечная дистрофия Дюшена - это генетическое заболевание, которое характеризуется быстрымразвитием мышечной дистрофии, приводящей к потере способности двигаться и впоследствии смерти,преимущественно болеют им мальчики.

Названо в честь французского невролога XIX в. ГийомаДюшена, впервые описавшего заболевание. Смерть обычно наступает из-за остановки сердца илипаралича дыхания в возрасте 25-30 лет. Каждый год в мире фиксируется 20 тыс. новых случаевмышечной дистрофии Дюшена, в России зарегистрировано примерно 3,5 тыс. больных с этимдиагнозом.Мышечную дистрофию Дюшена вызывают мутации в гене белка дистрофина - важного компонентаздоровых мышц. Один из подходов к лечению болезни - это коррекция мутации с помощьюсинтетического олигонуклеотида (короткого фрагмента ДНК или РНК ).

Такой препарат был недавновнедрен в США. При исследовании на лабораторных мышах с мышечной дистрофией Дюшенаобнаружено, что фосфорилгуанидиновые аналоги олигонуклеотидов работают не хуже зарубежныханалогов.Лечение заключается в удалении содержащего мутацию участка РНК при помощи синтетическогоолигонуклеотида, и замена его новым олигонуклеотидным фрагментом, в результате чего получаетсяфункциональный дистрофин.В планах исследователей - перейти к опытам на культурах клеток человека и на генномодифицированных животных по коррекции мутаций в человеческом гене дистрофина с помощьюновых аналогов олигонуклеотидов.NONA (non-uniformly charged nucleic acids) – не полностью заряженные олигонуклеотидные аналогиНовосибирскимибиоорганикамисформулированановаяконцепцияконструирования олигонуклеотидов НОНА (не полностью заряженныеолигонуклеотидные аналоги – non-uniformly charged nucleic acids, NONA). Волигомерах НОНА участки с отрицательным зарядом, несущие, например,фосфатные или тиофосфатные группы, сочетаются с электронейтральнымиучастками, несущими фосфорилгуанидиновые группы.