1631210421-a96b90a33588a5fa05cec0217194a441 (Лекция 6 - Химико-ферментативные методы синтеза нуклеотидов), страница 3

Синтезированширокий спектр подобных реагентов, служащих, например,для введения 5'-фосфата, аминогруппы, меркаптогруппы,альдегидной и карбоксильной групп, алкиновых фрагментов,флуоресцентных красителей и тушителей, гидрофильных игидрофобных модификаций, биотина.Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидовДругой метод, основанный на использовании в качестве синтонов производных нуклеотидов с фосфором в степени окисления III, обычноназывают Н-фосфонатным методом синтеза. Удлинение олигонуклеотида в Н-фосфонатном методе проводится по той же схеме, что и прифосфитамидном – ранее синтезированный олигонуклотид содержит на 5’-конце защищенную диметокситритилом ОН-группу.

Защитная группаудаляется перед каждой последующей конденсацией, после чего присоединяется следующий Н-фосфонат. Н-фосфонаты активируютсяобработкой пивалоилхлоридом. Конденсация приводит к образованию Н-фосфонатдиэфирной связи согласно ниже приведенной реакции. Методчаще всего используют для постадийного наращивания цепи, растущей в направлении 5’-конца.

В этом случае здесь R – нуклеозид, а R’ –удлиняемый олигонуклеотид с деблокированной 5’-концевой ОН-группой. Как и в фосфитамидном методе, каждая стадия конденсации проходитза минуты.Межнуклеозидные Н-фосфонатные связи достаточно стабильны и могут подвергаться окислению до фосфата не на каждой стадии синтеза, как вфосфитамидном методе, а после завершения образования полинуклеотидной цепи.O(CH3)3-C-CORO-P-OH-+R'OHClORO-P-OR'H+Cl-Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидовCинтез Н-фосфонатного синтона из нуклеозида исалицилхлорфосфита, который получают обработкойсалициловой кислоты PCl3OHO+PCl3Написать структуру продукта активацииPOCOOHН-фосфонаты активируют обработкой пивалоилхлоридом.Cl+2HClOOOPOClO(MeO)2TrO+BO(MeO)2TrOBRO-P-OOHOOPтриэтиламмоний бикарбонатOHOCOO(MeO)2TrO-OOP OHBН - фосфонат(CH3)3-C-CO-+R'OHClORO-P-OR'H+Cl-Н-фосфонатный метод синтеза олигонуклеотидов.Дополните схему недостающимися реагентамиИспользуют нуклеозидные H-фосфонаты в качестве строительных блоков.В качестве активаторов – пивалоилхлорид (CH3)3CC(O)Cl или 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорида (TIPS-Cl).Две стадии синтетического цикла:1) Удаление диметокситритильной защиты.2) Конденсация.

Конденсация приводит к образованию Н-фосфонат-диэфирной связи, которые достаточно стабильны и могутподвергаться окислению до фосфата не постадийно, как в фосфитамидном методе, а после завершения образованияполинуклеотидной цепи.20АНТИСМЫСЛОВЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ АНАЛОГИС точки зрения практического использования антисмысловыхолигонуклеотидов особенно существенны две главныеособенности таких препаратов:1)любые олигонуклеотиды могут быть получены по единойтехнологии, т.е.

в случае реализации этого принципафактически можно организовать производство, пригодноедля создания любых противовирусных и противоопухолевыхпрепаратов.2)В случае приспособления вируса или опухоли путеммутаций к воздействию определенного антисмысловогоолигонуклеотида достаточно установить природу этоймутации и синтезировать антисмысловой олигонуклеотид кмутировавшему вирусу.Первой работой, в которой был продемонстрированантисмысловой эффект олигонуклеотидов на биологическийобъект, была опубликованная в 1978 г. статья американскихученых Замечника и Стефенсона, которым удалось подавить спомощью антисмысловых олигонуклеотидов развитие в культуреклеток РНК-содержащего вируса саркомы Рауса. И вскоре послеэтого стали возникать, первоначально в России, США иФранции, группы исследователей, посвятившие своюдеятельность антисмысловой технологии.Серьезным осложнением является деградация олигонуклеотидовпод воздействием внутриклеточных, а в случае многоклеточныхорганизмов – и внеклеточных нуклеаз (например, в плазмекрови).

Для преодоления этой трудности биоорганикамипредложен ряд подходов, среди которых широко используемымявляется применение фосфоротиоатных аналоговолигонуклеотидов, устойчивость которых к гидролизумежнуклеотидной связи существенно выше, чем в случаеклассических фосфодиэфиров.Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидовК настоящему времени допущено на фармацевтический рынок США лекарство VitraveneTM,которое представляет собой 21-звенный фосфоротиоат [Yan. J.

Chem. Perkin Trans.2002]Тиофосфатные олигонуклеотиды — это модифицированныеолигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода вфосфатном остатке замещен на атом серы. Широкоиспользуются только те тиофосфаты, в которых сера неявляется связующим звеном между нуклеозидным остаткоми атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серуприводит к образованию нового центра хиральности наатоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотидаобразуются SP- и RP-диастереомеры. В n-мерномолигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидныхсвязей являются тиофосфатными, число диастереомеровсоставляет 2(n-1).• Будучи неприродными аналогаминуклеиновых кислот, олигонуклеотидныетиофосфаты значительно более устойчивык гидролизу нуклеазами.

Это свойствоопределяет использование тиофосфатов вкачестве антисмысловыхолигонуклеотидов в приложениях in vivo,где неизбежно воздействие нуклеаз.Подобным образом, чтобы увеличитьстабильность в малых интерферирующихРНК, часто вводят, по крайней мере, однутиофосфатную связь в 3'-положениесмысловой и антисмысловой цепи. Воптически чистых олигонуклеотидныхтиофосфатах диастереомеры, в которыхвсе фосфорные центры имеют SPконфигурацию, более устойчивы кферментативному гидролизу, чем их RPаналоги.

Однако, синтез оптически чистыхтиофосфатов сложен. В лабораторнойпрактике обычно пользуются смесямидиастереомеров.Тиофосфатные аналоги олигонуклеотидовПолучают модифицированным Н-фосфонатным методом;можно амидофосфитным методом на твердой фазе;Стадия окисления заменяется реакциейсульфурирования. Кэпированиепроводится после сульфурирования.3-(Диметиламинометилиденамино)-3H1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT)обеспечивает высокую скоростьсульфурирования и обладаетстабильностью в растворе. РеагентБокажа (Beaucage Reagent) имеет болеевысокую растворимость в ацетонитриле иобеспечивает протекание реакции за болеекороткое время. Однако, он имеетограниченную стабильность в растворе именее эффективен при сульфурированиисвязей РНК.Олигонуклеотиды – агенты избирательногодействия на первопричину болезниОлигонуклеотид3´ T5´G C A 5´C C A C G T C C 3´Универсальность использованияолигонуклеотидов обусловлена возможностьюпрямой реализации принципа:«есть мишень – есть направленный агент»Речь о других аналогах олигонуклеотидов пойдет вследующей лекции.