1631210421-a96b90a33588a5fa05cec0217194a441 (Лекция 6 - Химико-ферментативные методы синтеза нуклеотидов), страница 2
Описание файла
PDF-файл из архива "Лекция 6 - Химико-ферментативные методы синтеза нуклеотидов", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биоорганическая химия" из 8 семестр, которые можно найти в файловом архиве НГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с НГУ, его также можно найти и в других разделах. .
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Нуклеозиды с селективно защищенной 2’-ОНгруппой далее превращаются в синтоны дляфосфитамидного олигонуклеотидного синтеза. Защитнаягруппа удаляется после завершения синтеза всей цепиобработкой тетрабутиламмоний фторидом.ЗАЩИТНЫЕ ГРУППЫ ПРИ СИНТЕЗЕ ОЛИОРИБОНУКЛЕОТИДОВС целью селективного введения защитной группы по 2’гидроксигруппе используют реагент Маркевича – 1,3дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдислоксан. С его помощьюможно просилировать одновременно 5’- и 3’-ОН-группынуклеозида. Дальнейшее алкилирование по 2’-ОН группе(например, MeI в присутствии AgO, или дигидропираном)приведет к селективному введению по ней постояннойзащитной группе.
Остаток, образовавшийся при действииреагента Маркевича, удаляется обработкой триэтиламмонийфторидом, что приводит к синтону с селективноблокированной 2’-ОН-группой.Фосфитнаягруппатакжесодержитдиизопропиламиннуюгруппу(i-Pr2N),реакционноспособную в кислых условиях. При активации путем протонирования эта группазамещается 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида, иммобилизованного на твёрдой фазеФосфитный триэфирный метод (амидофосфитный подход).Фосфитная группа содержит диизопропиламинную группу, реакционноспособную в кислых условиях. При активациипутем протонирования эта группа замещается 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида, иммобилизованного натвёрдой фазе. В качестве катализатора используют соединения на основе азола, например, 1Н-тетразол.
В качествезащиты в фосфитной группе в настоящее время обычно используют цианэтильную группу.ТВЕРДОФАЗНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДОВСпецифической особенностью синтеза олиго- и полинуклеотидов является огромное число идентичных по типу реакций стадий, которыенеобходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи.
Образование каждой межнуклеотидной связи требует самой конденсации и удалениявременных защитных групп перед проведением последующей стадии. Кроме того. при фосфитамидном синтезе после каждой стадииобразования новой Р-О-связи необходимо провести окисление фосфитэфирного остатка до фосфоэфирного. Основная трудностьклассического синтеза состоит в том, что на каждой его стадии для гарантии чистоты полученных молекул олигомера необходимо тщательноотделять их от избытка исходных синтонов, продуктов их превращения, побочных продуктов реакции и вспомогательных реагентов. Для этогона каждой стадии необходимо подбирать условия такой очистки: кристаллизация, переосаждение, хроматография и др.
Для синтеза олигомера,состоящего из n остатков мономера, нужно не менее 2n раз (а то и значительно больше!) очищать продукты реакции. Таким образом, синтез вклассическом варианте сопряжен со значительными затратами труда, времени и материала.В 1963 г. американский химик-биоорганик Роберт Меррифилд предложил новый принцип проведения последовательных стадий удлинениярастущей полимерной цепи, позволяющей в значительной мере избежать перечисленных осложнений. Было предложено осуществлять синтезнерегулярного биополимера путем пошагового удлинения полимерной цепи, ковалентно связанной с нерастворимым полимерным носителем,с поочередным добавлением раствора синтона или раствора для деблокирования временной защитной группы. После проведения каждойстадии процесса нетрудно осуществить отделение связанного с нерастворимым носителем продукта реакции от находящихся в растворекомпонентов, например, простым фильтрованием.
Все эти процессы, а также присоединение первого звена создаваемого полимера кносителю и удаление синтезированного продукта являются гетерогенными процессами, происходящими с участием твердой фазы. Поэтомупроцесс называют твердофазным синтезом биополимеров.Универсальные носители• В более удобном методе синтез начинаетсяс универсального носителя, к которомуприсоединён ненуклеозидный линкер.Амидофосфит,соответствующий3'терминальномунуклеозиду,присоединяетсякуниверсальномуносителю по стандартной методике в ходепервого синтетического цикла. Затемпродолжаетсясборкатребуемойпоследовательности,послечегоолигонуклеотид снимается с поверхностиносителя.
Характерной особенностьюуниверсальных носителей является то,чтоотщеплениеолигонуклеотидапроисходит путём гидролиза связи P-O,соединяющей 3'-O-атом 3'-терминальногоолигонуклеотидасуниверсальнымлинкером.Преимуществоданногоподходазаключаетсявтом,чтоединственный универсальный носительможет быть использован во всех синтезахнезависимооттого,какуюпоследовательностьнеобходимосинтезировать.ТВЕРДОФАЗНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДОВВ случае твердофазного синтеза олигонуклеотидов синтез проводят, начиная с 3’-конца синтезируемой цепи, для чего на нерастворимомносителе закрепляют будущий 3’-концевой нуклеозид.Синтез лучше протекает на ненабухающих или слабонабухающих твердофазных носителях.
Наиболее часто используемыми носителямиявляются CPG (controlled pore glass, стекло с регулируемым размером пор) и MPPS (макропористый полистирол).Носители 1 и 2 – универсальные.3 – нуклеозидный. В исторически первом, хотя и менее популярном в настоящее время подходе, синтез олигонуклеотида проводится наносителе, к которому заранее, через фрагмент янтарной кислоты, ковалентно присоединён 3'-концевой нуклеозид.
Соответственно, синтезначинается с присоединения амидофосфита, соответствующего не первому, а второму нуклеотиду, считая с 3'-конца. Недостатком такогоносителя является то, что для синтеза определённого олигонуклеотида необходимо выбирать конкретный вариант нуклеозидного носителя,что уменьшает производительность синтетического процесса и увеличивает вероятность человеческой ошибки.4 – специальный. Специальные носители используются для присоединения некоторой функциональной или репортерной группы к 3'положению синтетических олигонуклеотидов. Коммерчески доступны носители для введения аминогрупп, меркаптогрупп, тушителейфлуоресценции и др.Гидролиз Р-О связи при отщеплении от универсального носителяФОСФОТРИЭФИРНЫЙ ФОСФИТАМИДНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВФосфитная группа содержит диизопропиламинную группу,реакционноспособную в кислых условиях. При активации путемпротонирования эта группа замещается 5'-гидроксильной группойолигонуклеотида, иммобилизованного на твёрдой фазе.
В качествекатализатора используют соединения на основе азола, например, 1Нтетразол.Отсутствие промежуточных очисток растущего на носителеолигонуклеотида приводит к накоплению ошибок, неизбежновозникающих на каждой стадии. Самая неприятная ошибка – этонеполное проведение реакции конденсации с каждым очереднымсинтоном, что неизбежно приводит к получению олигонуклеотидов сукороченной последовательностью и пропусками. Поэтому каждуюстадию конденсации проводят, используя достаточно большие избыткисинтонов.
Чтобы избежать по возможности пропусков, после обработкирастущей цепи очередным синтоном проводят обработку уксуснымангидридом. Эта небольшая, по сравнению с синтоном, молекула можетдотянуться до тех 5’-ОН-групп, которые по стерическим причинам невступили в реакцию с синтоном.
Ацетилирование ОН-групп делает ихнедоступными для реакции с последующими синтонами. Данная стадияполучила название кэпирования (при синтезе). Она являетсяобязательным звеном при синтезе на полимерном носителе.В случае фосфитамидного метода после образования очередной связинеобходимо провести окисление фосфитной связи до фосфатной. Назаключительной стадии, помимо деблокирования защитных групп,проводится отщепление образовавшегося олигонуклеотида от носителя.Выделенный олигонуклеотид далее подвергается очистке, посколькудаже при очень высоких выходах на стадиях конденсации не удаетсяполностью избежать некоторой примеси более короткихолигонуклеотидов.
Окончательная очистка, как правило, проводится спомощью анионообменной хроматографии или гель-электрофореза,которые разделяют смесь полученных продуктов по длине.Фосфитный триэфирный метод (амидофосфитныйподход).Дополните схему отсутствующими реагентами.ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВПроизводные олигонуклеотидов создаются для придания имнекоторых новых свойств. Для детекции флуоресцентнымиметодами широко используется присоединение колигонуклеотидам соответствующих красителей; дляпридания им гидрофобности с целью облегчить ихпрохождение через биологические мембраны их связывают собъемными неполярными радикалами. Несвойственнуюреакционную способность можно обеспечить путемприсоединения к ним соответствующих химически активныхгрупп.
Для придания им специфической сорбируемости натвердых носителях к ним присоединяют специальныерадикалы, например, биотин для сорбции на носителях,содержащих стрептавидин.Производные олигонуклеотидов применяются как в самойбиоорганической химии. Так и в ее многочисленныхприложениях. Практически все задачи, связанные сприменением производных олигонуклетидов, предполагаетиспользования их способности к высокоспецифичнымвзаимодействиям. Поэтому получение производных недолжно сопровождаться нарушениями тех элементовструктуры, которые обеспечивают такие взаимодействия.Ненуклеозидные амидофосфиты 1-11 применяются длявведения в олигонуклеотид различных групп, которые невстречаются в природных нуклеозидах.