1631210415-34cffe9f0a7933ab4efde4228c7cf1e4 (Лекция 21 - Секвенирование), страница 2

Эпигенетические параметры имеют первостепенноезначение для расшифровки механизмов сомаклональной изменчивости, характеристики и идентификации клонови клеточных культур (стволовые клетки) и их направленной дифференцировки. Целенаправленное изменениеметилирования ДНК служит эффективным биотехнологическим средством активации экспрессии генов запасныхбелков семян у растений и, например, наследуемого увеличения белковости зерна пшениц.Необходимость выяснения какова химическая и биологическая специфичностьметилирования ДНК у эукариотических организмов высветила перед биоорганиками важнуюзадачу: разработать подход для выявления участков в ДНК, которые подвергаютсяметилированию.Бисульфитное секвенирование ДНКРЕАКЦИИ ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ С БИСУЛЬФИТОМ НАТРИЯБисульфит-ион способен обратимо присоединяться к С5С6-двойным связям цитозина, урацила и тимина вмягких условиях, образуя соответствующий аддукт,неустойчивый в случае тимина; практическое значениеимеют только реакции с урацилом и цитозином.Продукты присоединения к урацилу и цитозину довольностабильны в нейтральной кислой средах, но отщепляютбисульфит-ион в щелочной среде.Важным свойством 5,6-дигидропроизводных цитозинаявляетсяповышеннаяреакционноспособностьаминогруппы, которая легко замещается под действиемразличныхнуклеофильныхагентов.Замещениеаминогруппынагидроксигруппуприводиткпроизводному урацила, которое легко превращается вурацил при слабоосновных значениях рН.

Такимобразом, эта реакция дает возможность специфическогопреобразования цитозиновых колец в урацильные.17Бисульфитное секвенирование ДНКРЕАГЕНТЫ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНКРеакция с OsO4, широко применяемая в органическойхимии для гидроксилирования двойных связей, гладкопротекает и в случае пиримидиновых оснований. Скоростьреакции возрастает в ряду m5C ТUC, так, тимидинреагирует почти на два порядка быстрее цитидина и в 10раз быстрее уридина. Поэтому ее можно рассматривать какспецифический метод модификации 5-метилцитозина итимидина.При взаимодействии с OsO4 образуетсяциклический эфир осмиевой кислоты, который легкогидролизуется до диола. Диольные соединения такжеобразуются и при взаимодействии с MnO4 и H2O2.

Однако вэтом случае быстро происходит разрушение цикла.СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПО СЭНГЕРУ И МАКСАМУ-ГИЛБЕРТУМетод Максама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном принципе. В первом используется специфическоерасщепление ДНК, обусловленное природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийсяна каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного(статистического) набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырех нуклеотидов.Химический метод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемая ДНК неслишком велика (200-500 звеньев).

В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучшеприменять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера), чтобы не вводить процедуру рестриктазногорасщепления с выделением индивидуальных фрагментов.ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ РЕГИСТРАЦИИМеченные терминаторы. Задачабиооргаников – разработать такиефлуоресцирующие производныетерминаторов, которые, несмотряна присоединение к основаниюобъемистого радикала, сохранялибы субстратные свойства.Четыре терминатора – производные четырех dNTP, которыевозбуждаются при 488 нм, но дают четыре разных спектрафлуоресценции.

Это позволяет проводить электрофорезпродуктов репликации в одном капилляре, однако регистрироватьне только сам факт флуоресценции, но и спектр каждоговыходящего из капилляра продукта терминации, что позволяетидентифицировать последовательно каждый входящий в продуктрепликации терминирующий дидезоксинуклеотид.Принцип метода секвенирования поРотбергуОднонитевыефрагментыДНК(1)прикрепляются к бусинам (2) и помещаютсяв капельки эмульсии (3). В результатеполимеразной цепной реакции в каждойкапелькеобразуетсямножествоидентичных копий фрагмента (4) — этонеобходимо для усиления сигнала. Бусины сДНК помещают в шестигранные колодцы(5),гдепроходитреакцияпиросеквенирования.Присоединениеочередного нуклеотида вызывает вспышкуфлуоресценции.Еслиприсоединяетсянесколько одинаковых нуклеотидов подряд,вспышка бывает более яркой (6).

Теперьпоместим пластинку в специальный прибори будем омывать ее по очереди четырьмярастворами, содержащими нуклеотиды, —Т, С, A, G. Когда очередное основаниеприсоединяется к цепочке, высвобождаетсяпирофосфат и запускает флуоресценцию,посколькувячейках,помимоДНКполимеразы, присутствуют люцифераза илюциферин. Принцип этого метода —секвенирование методом синтеза, оно жепиросеквенирование или секвенирование вреальном времени, — впервые описал в 1988году Эдвард Химан (Edward Hyman).22ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЕКак и в случае метода Сэнгера, речь идет осинтезе новой молекулы ДНК наанализируемой матрице.

Существенно, чтоДНК-матрица может быть закреплена наносителе, причем найдены системы, вкоторых ДНК-полимераза нормальнофункционирует на такой закрепленнойматрице. Присоединение нуклеозид-5’трифосфата сопровождается отщеплениемостатка пирофосфата. Таким образом, фактудлинения растущей цепи может бытьзарегистрирован по появлению новоймолекулы пирофосфата. Естественно, что придобавлении dNTP, не соответствующегосчитываемому на данном шаге нуклеотидуДНК-матрицы, пирофосфат не образуется.Образование пирофосфата может бытьзарегистрировано разными методами, однаконаиболее перспективным оказался метод.Основанный на превращении пирофосфата вмолекулу АТР, которое осуществляетсяферментативно, например, с помощьюфермента сульфурилазы.

Образование АТРможет с высокой чувствительностью бытьзарегистрировано по его взаимодействию слюцеферином, который по реакции с АТРпревращается в люцефериладенилат,способный при участии специальногофермента – люциферазы – взаимодействоватьс молекулярным кислородом с испусканиемкванта света..