1631210415-34cffe9f0a7933ab4efde4228c7cf1e4 (Лекция 21 - Секвенирование)

Подходы к установлению нуклеотиднойпоследовательности в ДНКЧТО НУЖНО ЗНАТЬ ПОСЛЕ ЛЕКЦИИХимическая, пострепликационная и посттрансляционная модификации нуклеиновых кислот.Подходы к установлению нуклеотидной последовательности в ДНК.Основные принципы секвенирования по Максаму и Гилберту. Модификация диметилсульфатом. Расщепление ДНК погуанозиновым звеньям через модификацию диметилсульфатом. Действие гидразина и его производных. Раскрытиепиримидинового цикла. Расщепление ДНК по остаткам цитозина гидразином при высокой концентрации NaCl.Деградация ДНК по остаткам пиримидинов после обработки гидразином в отсутствие NaCl. Окислениечетырехокисью осмия.Метод Сэнгера (определение последовательности ДНК методом ДНК-полимеразного копирования в присутствиитерминирующих аналогов дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов).

Использование в качестве терминаторов репликациидидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками. Донорно-акцепторные пары для одноволнового возбужденияфлуоресцентного красителя с последующей многоволновой детекцией.Пиросеквенирование. Закрепление ДНК-матрицы на носителе. Способы детекции пирофосфата после очередногоудлинения растущей цепи. Преимущество параллельного пиросеквенирования перед методом СенгераБисульфитное секвенирование ДНК.

Анализ профилей метилирования ДНК посредством высокопроизводительногобисульфитного секвенирования и гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах.3Предпосылки возникновения методов секвенированияВ отечественной литературе методы расшифровки нуклеотиднойпоследовательности нуклеиновых кислот принято называтьметодами секвенирования.Следует обратить внимание на правильность написаниятерминов: сЕквенирование нуклеотидной последоватильности носИквенс гена.Еще в 50-е годы прошлого века были разработаны методы,позволяющие определять последовательность аминокислот вполипептидной цепи. Теоретически это несложно, поскольку всеаминокислоты, встречающиеся в природных белках, имеют разныесвойства.

Поэтому, когда был расшифрован генетический код,появиласьвозможностьвосстанавливатьнуклеотиднуюпоследовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотнойпоследовательностисоответствующегобелка.Однако,генетический код является вырожденным. Следовательно,первичная структура ДНК, полученная на основе анализапоследовательности аминокислот, не является однозначной.Кроме того, для эукариот таким способом можно восстановитьлишь нуклеотидный состав экзонов, тогда как информация осоставе интронов теряется в результате сплайсинга.4Основные принципы секвенирования по Максаму и ГилбертуВ 1976 г.

А. Максамом и У. Гилбертом был разработан методсеквенирования, основанный на специфической химическойдеградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одногоконца. В 1977 г. Максамом и Гилбертом был предложен методсеквенирования,основанныйнаселективнойхимическоймодификации различных типов гетероциклических оснований всоставе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидныхсвязей в модифицированных звеньях. Реакции селективноймодификации по каждому типу гетероциклических основанийпроводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК всреднем модифицировалось только одно звено данного типа.Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентныи реагируют с модифицирующим агентом с одинаковымискоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажетсячастично модифицированным.

Дальнейшая обработка ДНКвторичным амином или щелочью приводит к отщеплениюмодифицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК иразрывуполинуклеотиднойцепивместахотщеплениягетероциклов.Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевомунуклеотидномузвену.Радиоактивнаяметкавводитсяфосфорилированием с помощью 32Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы.5Основные принципы секвенирования по Максаму и ГилбертуФрагмент ДНКМодификация азотистогооснованияОтщепление или замещениемодифицированного основанияРазрыв сахаро-фосфатной цепи ДНКОтщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработкивторичным амином или щелочью.Таким образом, в результате химической деградации получается наборфрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментовсоответствуют положению мономерных звеньев того типа, которыйподвергался модификации.

Концевая радиоактивная метка служит точкойотсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК.6Основные принципы секвенирования по Максаму и ГилбертуХимическая деградация ДНКНабор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ,который позволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся подлине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов вДНК читается непосредственно с радиоавтографа геля.Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичнойструктуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16звенных) олигодезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае реакциихимической модификации проводят в более жестких условиях (увеличиваявремя и температуру реакции) с целью повышения степени модификации.7Основные принципы секвенирования по Максаму и ГилбертуНабор реакций, применяемых для расщепления ДНК помономерным звеньям определенного типа достаточно велик ипостоянно пополняется:по остаткам гуанина – обработка диметилсульфатом;по остаткам аденина и гуанина – апуринизация 50%-ноймуравьиной кислотой (по Бартону);поостаткамаденинаицитозина–расщеплениегетероциклических оснований под действием 1,2 Н NaOH;по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином.В настоящее время широко используются два основных вариантасеквенирования по Максаму — Гилберту.

В первом из них реакциихимической модификации ДНК проводят в растворе, а во второмДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (например,ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, егомногочисленные модификации с успехом использовались длясеквенирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числеолигонуклеотидов.

В то же время второй метод имеет рядпреимуществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени,проще в освоении, позволяет обойтись минимальным наборомоборудования. В целом оба метода обеспечивают получение вполнеприемлемых результатов, а выбор одного из них определяетсяконкретными условиями лаборатории.8Взаимодействие нуклеиновых кислот и их компонентов с диметилсульфатом. Механизм SN1 или SN2?В ДНК метилированию подвергаются атомыN(3) аденина, выходящие в малую бороздку Вформы ДНК, в большей степени атомы N(7)гуанина, выходящие в большую бороздку.Можно добиться 80%-ной модификацииостатков гуанозина без затрагивания другихнуклеозидов. Основания двуцепочечных ДНК,метилированные по атомам N(3) и N(7),продолжают образовывать комплементарныепары, но эффективность их взаимодействияпонижается.При метилирование тРНК диметилсульфатомв водной среде при рН 5,0 достигается 50%ное метилирование по остаткам гуанозина беззатрагивания других нуклеозидов.СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ПОМАКСАМУ-ГИЛБЕРТУ7-метилгуанин и метиладенин легко отщепляются отполидезоксирибонуклеотидной цепи в результатеразрыва N-гликозидных связей.

Далееполинуклеотидная цепь может быть легкорасщеплена по модифицированному звену действиемщелочи или аминов.Пи определенных условиях такой метод деградацииможет быть использован для локализациигуаниновых звеньев в последовательности ДНК. Длялокализации адениновых и гуаниновых звеньевиспользуют муравьиную кислоту.Что будет происходить с остатком аденина и гуанинапри кислых значениях рН?Расщепление молекулы ДНК по АП-сайтуOOBI - 1OBI - 1OOOBI - 1O-OOO-OP-OOOOOHOPOPOOPOBI +1+O+B'-H+OOHCHOO..B'HO--O-OOOPOH..B'CHHO-OOOOOBI +1POOOBI+1OOOOBI -1H2COHCH+O-OPO++B'-H-O11СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ПО МАКСАМУ-ГИЛБЕРТУ.РЕАКЦИИ ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ C ГИДРАЗИНОМДля определения положениятимидинаицитозинаиспользуется деградация поостаткам пиримидинов, длячего ДНК последовательнообрабатывается гидразином,а затем пиперидином.РЕАКЦИИ ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ C ГИДРАЗИНОМ (цитозин)В щелочных условиях реакции сгидразином приводят красщеплению гетероциклическихколец пиримидинов,практически не затрагиваяпуриновых оснований.Расщепление по цитозину осуществляетсяпри высокой концентрации NaCl споследующей обработкой продуктовмодификации пипердином.

ПОЧЕМУ?Рисунок электрофореграммы,полученной для олигонуклеотида d(AAGAAGGCCTCTGGAAGC)14Анализ профилей метилирования ДНК посредствомвысокопроизводительного бисульфитного секвенированияМетилирование ДНК – биохимическая природа наследуемых эпигенетических сигналов.Нарушение метилирования ДНК и искажение других эпигенетических сигналов приводят к преждевременномустарению и таким заболеваниям, как рак, диабет, астма, различные тяжелые психические расстройства и др.Необходимо знать: какие участки ДНК подвергаются метилированию!Метилирование ДНК – первый материальный химически идентифицированный и расшифрованныйэпигенетический сигнал. Сегодня доподлинно известно, что метилирование ДНК в клетке – не пустяк: оноконтролирует все! генетические процессы, в том числе и такие, как транскрипция, репликация, рекомбинация,транспозиция генов, репарация, инактивация Х-хромосомы (половая дифференцировка).

Не удивительно, что кизучению этой относительно небольшой энзиматической модификации генома сейчас прикован очень большойинтерес многих исследователей мира: молекулярных биологов, биохимиков, генетиков, медиков, а такжебиооргаников.Появление остатков 5-метилцитозина (m5C) в ДНК существенно сказывается на взаимодействии ДНК с разными,в том числе и регуляторными, белками.

Часто метилирование ДНК блокирует связывание ДНК с такими белкамии препятствует транскрипции генов, а иногда оно наоборот является обязательным условием для связываниябелков. Существуют даже специальные m5CрG ДНК связывающие белки. Связывание таких белков с ДНКаранжирует весь ансамбль белков транскрипционного аппарата и необходимо для его активности. Таким образом,метилирование ДНК может служить сигналом как позитивного, так и негативного контроля за активностьюгенов.Метилирование ДНК у эукариот видо- и тканеспецифично, оно контролируется гормонами, изменяется свозрастом и является одним из механизмов клеточной и половой дифференцировки. Метилирование ДНКконтролирует все генетические процессы (репликация ДНК, репарация, рекомбинация, транскрипция и др.).Нарушение метилирования ДНК и искажение других эпигенетических сигналов приводят к преждевременномустарению и таким заболеваниям, как рак, диабет, астма, различные тяжелые психические расстройства и др.Профиль метилирования ДНК изменяется при канцерогенезе, служит надежным диагностическим признакомразных форм рака уже на ранних этапах канцерогенеза.