12636 (Взаимодействия белков с РНК – структурный компьютерный анализ)

Взаимодействия белков с РНК – структурный компьютерный анализ

Курсовая работа

Выполнила студентка 4 курса, 541 группы Ревтович Светлана

Самарский Государственный Университет

Самара 2001

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Отличия ДНК-белковых от РНК-белковых взаимодействий

Двойная спираль ДНК – это регулярная структура, в которой наиболее существенные отличия между соседними участками заключены в последовательности пар оснований. В обоих желобках специфический сайт ДНК для узнавания белком может быть сформирован сетью водородных связей между основаниями нуклеотидов. Большой желобок спирали ДНК доступнее для контакта, что создаёт возможность для дискриминации последовательностей в нём [39]. Основанный на этом предположении механизм узнавания «прямым считыванием» был подтверждён для многих ДНК-связывающих белков. Также было отмечено потенциальное значение и «непрямого считывания». Некоторые последовательности ДНК могут иметь изменения в конформации сахаро-фосфатного остова или даже быть деформированы в необычные структуры. В таком случае специфичность связывания может определяться контактами белка с остовом ДНК [40]. Индуцированные белком нарушения структуры ДНК довольно обычны и могут варьировать по форме от небольших изгибов, как в сайте нуклеазы EcoRI, до больших изгибов и выведения оснований из стэкинга, как в комплексе с ТАТА-связывающим белком [24].

Механизм «прямого считывания» предполагает, что ДНК-белковыми контактами, определяющими специфичность связывания, являются водородные связи с основаниями и гидрофобные контакты с тиминовыми метилами, в то время как энергия неспецифического связывания обеспечивается ионными и водородными связями с сахаро-фосфатным остовом. В «непрямом считывании» могут принимать участие и другие виды взаимодействий, например, в комплексе с ТАТА-связывающим белком ДНК контактирует с гидрофобной белковой поверхностью и ароматические аминокислоты интеркалируются в спираль ДНК [24].

Молекулы РНК отличаются от ДНК несколькими особенностями, которые влияют на возможности белкового узнавания. Во-первых, в РНК участки Уотсон-Криковских спиралей часто прерываются выпячиваниями, внутренними петлями и шпильками. Исследования часто встречающихся «четырёхнуклеотидных» шпилек и консервативных внутренних и шпилечных петель рибосомной РНК, методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа выявили специфические нерегулярные структуры, содержащие неканонические пары и выпячивания. Во-вторых, спирали РНК достаточно короткие, обычно меньше полного оборота, и имеют А-форму, отличную от В-формы ДНК. А-форма спирали имеет очень глубокий и узкий большой желобок, что создаёт стерические затруднения для взаимодействия с белками. Однако прилегающий к нерегулярным участкам большой желобок может быть доступен для связывания [41].

Следствием этих отличий является то, что белки оказываются перед значительно большим разнообразием водородных связей и возможностей стэкинга нуклеотидов в случае РНК, чем это возможно в стандартной спирали ДНК. Дополнительной и весьма важной особенностью РНК является возможность «третичных» взаимодействий, которые могут соединять различные участки РНК и создавать сложные структуры. Классическими примерами являются соединение спиралей тРНК в «L-образную» молекулу, обнаруженная в интронах группы I «аденозиновая платформа», открывающая спираль РНК для стэкинга с другой спиралью РНК [12], и структура двух взаимодействующих петлями транскриптов RNA I и RNA II плазмиды ColE1, так называемый «kissing» комплекс [27]. Тот факт, что благодаря вторичным и третичным взаимодействиям может быть создана уникальная структура РНК, повышает вероятность специфического взаимодействия белков только с сахаро-фосфатным остовом. Эта ситуация может быть крайним случаем «непрямого считывания», когда основания нуклеотидов обеспечивают белковое узнавание только определением общей конформации РНК, а не прямыми контактами с белком.

Таким образом, искажение регулярной структуры нуклеиновой кислоты, по всей видимости, более важно для узнавания РНК, чем для ДНК. Спираль ДНК довольно стабильная структура, в то время как неспаренные нуклеотиды и петли дестабилизируют структуру РНК. Комбинация богатого выбора нерегулярных структур в РНК и возможности деформации её структуры позволяют предположить, что РНК-связывающие белки будут использовать более широкий выбор стратегий связывания, чем ДНК-связывающие белки, и что механизм узнавания «непрямым считыванием» будет среди них более широко распространён.

1.2. Ранние представления об РНК-белковых взаимодействиях

1.2.1. РНК-связывающие структурные мотивы в белках

Изучение свойств РНК-связывающих белков привело к обнаружению в этих белках ряда и консервативных мотивов. Их открытие позволило начать классификацию РНК-связывающих белков, исходя из их структурных особенностей, а также предсказывать РНК-связывающие свойства белков [8]. В настоящее время выделяют следующие основные мотивы:

РНП (ribonucleoprotein) мотив - наиболее распространён, состоит из двух коротких последовательностей РНП1 (октамер) и РНП2, разделённых примерно 30 аминокислотами [17].

S1 мотив – в состав входит пять антипараллельных -тяжей. Ряд консервативных ароматических и заряженных аминокислот, расположенных в петле между тяжами 1 и 2, в середине 2, в конце 3 и в повороте между 4 и 5 находятся поблизости друг от друга и, вероятно, формируют РНК-связывающий участок домена [10].

Домен холодового шока – состоит из пяти -тяжей с РНП-последовательностью, расположенной в одном из тяжей и структурно очень схож с S1 мотивом [38].

КН мотив – содержит стабильную структуру.[11] Точная роль мотива в РНК-связывании неизвестна.

Мотив DSRM – имеет топологию. Возможный участок связывания находится в петле между -тяжем и С-концевой -спиралью [9].

RGG мотив – содержит 20-25 аминокислот и обычно имеется в комбинации с РНК-связывающими мотивами других типов. Он состоит из близкорасположенных поворотов Arg-Gly-Gly (RGG), расположенных среди других, часто ароматических аминокислот [8].

Мотив ARM – состоит из 10-20 аминокислот с большим количеством аргинонов. Встречается в вирусных и фаговых белках.

Домены с «цинковыми пальцами» - содержит последовательности СХ4СХ12НХ3-4Н и соответствующее число ионов цинка, связанные цистеинами и гистидинами [17].

Другие РНК-связывающие мотивы. Существует ряд других консервативных последовательностей, не имеющих гомологии с уже перечисленными мотивами. Например, мотив белка-аттенюатора триптофанового оперона из B.subtilis. [2].

1.2.2. Взаимодействия белков с тРНК

Вопрос о том, как аминоацил-тРНК-синтетазы достигают высокой специфичности в узнавании тРНК, вероятно, был одним из первых серьёзно изучаемых вопросов в проблеме РНК-белковых взаимодействий. Чтобы взаимодействовать со всеми компонентами трансляционного аппарата, все тРНК должны иметь достаточно схожую трёхмерную структуру, что значительно затрудняет для каждой из 20 синтетаз выбор своих изоакцепторных тРНК из пула тРНК клетки. В связи с этим, возможности к дискриминации весьма ограничены и, в основном, сведены к узнаванию нуклеотидов в специфических позициях.

К настоящему времени определены элементы узнавания для 19 из 20 синтетаз. Оказалось, что они неодинаковы для разных синтетаз. Большинство этих ферментов узнаёт одну или более из трёх следующих детерминант:

по меньшей мере, один нуклеотид в антикодоне;

одну или более из последних трёх пар нуклеотидов акцепторного стебля;

так называемое «дискриминаторное» основание между акцепторным стеблем и ССА концом.

Кроме того, по крайней мере, 8 синтетаз используют и другие отличительные признаки.

Элемент узнавания может влиять на специфичность аминоацилирования тРНК, потому что он узнаётся «правильной» синтетазой (позитивный элемент) или потому что предотвращает взаимодействие с «не своей» синтетазой (негативный элемент). Негативный элемент может маскировать присутствие позитивных элементов [32]. Яркой иллюстрацией этого факта являются наборы из трёх элементов специфичности около ССА конца тРНК для аланина, гистидина и глицина. Каждая детерминанта является позитивным элементом для одной или двух синтетаз и негативным для остальных [19].

Несмотря на выполнение одной и той же реакции аминоацилирования, синтетазы могут осуществлять различное связывание с субстратом реакции – тРНК, причём элементы узнавания тРНК не всегда являются уникальными, а могут иметь структурное сходство с другими классами белков.

1.2.3. Взаимодействия белков с матричными РНК

Механизм мРНК-белковых узнаваний является, пожалуй, наименее изученным вопросом в проблеме РНК-белковых взаимодействий, в виду отсутствия структур, решённых с достаточно высоким разрешением (исключение - комплекс L30-мРНК).

Однако, опираясь на данные полученные методом ядерного магнитного резонанса было сделано предположение, что основную роль в процессе мРНК-белкового узнавания играют приведённые ранее консервативные мотивы. Например, RNP1 и RNP2 (белок U1A), домен холодового шока и гидрофильный С-концевой домен с чередующимися кластерами отрицательно и положительно заряженных аминокислотных остатков (Y-box-белки).

1.2.4. Взаимодействия белков с рРНК

Взаимодействия белков с рРНК очень сильно отличаются от взаимодействий белков с ДНК и тРНК. Места связывания белков на ДНК и тРНК характерны наличием специфической эволюционно консервативной последовательности нуклеотидов, замена которых приводит к сильному ослаблению или исчезновению взаимодействий [1]. Предположение об определяющей роли последовательности нуклеотидов в РНК-белковом узнавании, основанное на исследованиях комплексов белков-репрессоров с ДНК и изучении аминоацил-тРНК-синтетаз, оказывается некорректным применительно к рРНК-белковым комплексам. Поскольку структура ДНК регулярна, именно последовательность оснований, а не конформация остова, определяет специфичность связывания. Подобное же можно сказать о комплексах аминоацил-тРНК-синтетаз с соответствующими тРНК, поскольку пространственные структуры тРНК однотипны и специфичность узнавания зависит именно от последовательности оснований в определённых участках молекулы тРНК.

рРНК, в отличие от ДНК и тРНК, содержит много нерегулярных участков, и рибосомные белки могут опознавать специфические конформации, образованные сахарофосфатным остовом таких участков. Места связывания рибосомных белков на рРНК можно разделить на две группы [18]. К первой относятся двухцепочечные спирали длиной до 40 нт, содержащие выпетливания (loops) или выпуклости (bulges), которые или искажают структуру спиралей нормальной А-формы, образуя уникальные конформации, опознаваемые белком, или же сами формируют места связывания. Вторая группа включает домены рРНК, имеющие сложную пространственную структуру, взаимное расположение сегментов которой стабилизируется рибосомными белками.

Для поиска предполагаемых мест РНК-белкового связывания в молекулах рибосомных белков используют две концепции:

Наличие кластеров эволюционно консервативных положительно заряженных или ароматических аминокислотных остатков в структурах белков может служить указанием на функциональную важность данной области молекулы при взаимодействии с рРНК;

Способность рибосомных белков к специфическим перекрестным взаимодействием с рРНК из эволюционно удаленных организмов позволяет использовать сравнение структур гомологичных белков для локализации возможных мест связывания рРНК и говорить о консерватизме пространственной структуры РНК-белкового интерфейса [31].

Дополнительно используют модификации белка генно-инженерными или биохимическими методами, которые заключаются в замене или химической модификации аминокислотных остатков или же в удалении части полипептидной цепи с последующей проверкой константы связывания.

1.3. Современные методы исследования РНК-белковых взаимодействий

1.3.1. Биохимические методы

К биохимическим методам относятся определение констант связывания на фильтрах, подвижность в геле и центрифугирование в градиенте сахарозы.

1.3.1.1. Связывание на фильтрах

Является стандартно используемой методикой для определения РНК-белковых взаимодействий и оценки константы связывания. Принцип данного метода основан на способности нитроцеллюлозных фильтров удерживать белки, а также связанные РНК, пока несвязанные РНК проходят через фильтр. Несмотря на свою концептуальную простоту, метод всё же не является достаточно надёжным и не подходит для изучения некоторых РНК-белковых комплексов: он хорошо работает для сравнительно небольших молекул РНК, большие же молекулы РНК-белковых комплексов часто не удерживаются.

Методика заключается в том, что эквимолярные количества радиоактивной РНК смешиваются с белком в различной концентрации и фильтруются через нитроцеллюлозные фильтры. В идеале при высокой концентрации белка должно удерживаться до 100% РНК, в действительности же этот процент значительно меньше. Кроме того, белковые фракции также могут не удерживаться фильтром. Например, при анализе взаимодействия белка L18 с 5S рРНК было обнаружено, что эффективность связывания комплекса 5SрРНК-L18 составляла 35% при удержании 65% белка L18, и < 5% для свободной 5S рРНК. Тем не менее, точность измерения не зависит непосредственно от эффективности задерживания.

На оценку эффективности связывания влияют многие параметры, и они должны быть оптимизированы для каждого конкретного случая:

Буфер: Повышение концентрации солей уменьшает эффективность связывания. Для большинства комплексов концентрация одновалентных ионов должна составлять около 150 mM, чтобы гарантировать специфичность связываться.