11234 (Асимметрия мембран), страница 3

добные молекулы, например фодрин, обнаружены в клетках разного типа.

1. Актин. Это глобулярный белок, который существует в виде линейных олигомеров, содержащих по 12—18 молекул. Они выглядят на электронных микрофотографиях как короткие стержни, к которым может быть прикреплено до шести спектриновых тетрамеров.

2. Анкирин. Это наиболее охарактеризованный растворимый белок, обеспечивающий взаимодействия между интегральными мембранными белками и цитоскелетом. Он имеет отдельные домены, ответственные за независимое связывание со спектрином и с цитоп-лазматическим доменом белка полосы 3. Анкирин был обнаружен и в неэритроидных клетках.

3. Белок полосы 4.1. Он также относится к классу белков, обеспечивающих связь цитоскелета с мембраной. Белок полосы 4.1 связывается со спектрином и актином, а также с гликофорином. Кроме того, при определенных условиях он может связываться и с белком полосы 3. Белку полосы 4.1, по-видимому, родствен синапсин I, обнаруженный в мембране синаптических везикул.

5. Белок полосы 3. Это основной анионный переносчик в эритроцитах. Цитоплазматический домен содержит на N-конце кислый участок, который связывается с некоторыми гликоли-тическими ферментами, а также с гемоглобином. Цитоплазматический домен не участвует в транспорте анионов. Его сегмент, расположенный вблизи мембраны, связывается с анкири-ном и с белком полосы 4.2. На основании анализа аминокислотной последовательности было высказано предположение, что белок полосы 3 имеет 12 трансмембранных сегментов, но полученные к настоящему времени экспериментальные данные не позволяют ни подтвердить, ни опровергнуть это положение.

6. Гликофорин А. Это основной сиалосодержащий гликопротеин; В отличие от белка полосы 3 он имеет относительно небольшой цитоплазматический домен и один трансмембранный сегмент. Полагают, что этот белок связывается с белком полосы 4.1. Другие его функции неизвестны.

Трансмембранная асимметрия липидов

Мембранные белки, находясь в плоскости бислоя, не меняют Свою топологическую ориентацию. Они встраиваются в мембрану в jCTporo определенной ориентации и остаются в таком положении в течение всего времени их жизни. Липиды ш ряде биологических мембран, напротив, с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую. Определить скорость трансмембранной миграции липидов очень важно по двум причинам: это помогает понять Природу липидной асимметрии и позволяет критически оценить пригодность методов, используемых для нахождения распределения липидов между двумя сторонами бислоя. Чтобы измерения содержа-1кия, например, фосфатидилсерина на наружной стороне мембранных везикул были достоверными, они должны быть завершены до того, как фосфатидилсерин из внутреннего монослоя переместится в наружный. Некоторые методы установления липидной асимметрии модифицируют саму изучаемую систему и индуцируют трансмембранную миграцию липидных молекул, поэтому полученные результаты бывает трудно интерпретировать. Детальная оценка достоинств и недостатков методов изучения липидной асимметрии в мембранах дается, например, в обзорах.

МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Химическая модификация фосфолипидов

Относительно легко подвергаются химической модификации только аминофосфолипиды, например фосфатидилсерин и фосфати-дилэтаноламин. При этом мембранный препарат с известной топологической ориентацией обрабатывают реагентом, который не проникает через бислой и ковалентно связывается со свободными аминогруппами тех аминофосфолипидов, которые находятся только на наружной поверхности мембраны. Чаще всего с этой целью используют ТНБС. Доля фосфатидилэтаноламина, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной стороне мембраны. Очевидно, однако, что такой вывод неправомочен, если реакция не доходит до конца или если в ходе реакции значительное количество фосфатидилэтаноламина перемещается с внутренней стороны мембраны на наружную и становится доступным для реагента. Как правило, в реальной ситуации имеют место оба обстоятельства, что значительно осложняет интерпретацию результатов.

Предложен вариант этого подхода, предусматривающий синтез аналогов фосфолипидов с реакционноспособными сульфгидрильны-ми группами с последующим использованием непроникающих реагентов, избирательно реагирующих по SH-группам. Естественно, что эти липидные аналоги следует включать в изучаемые мембраны перед обработкой реагентами, и желательно предварительно исследовать их поведение в модельных системах.

Фосфолипидный обмен

Спонтанный обмен фосфолипидами между мембранами, как правило, протекает с пренебрежимо малой скоростью. Однако были выделены белки, называемые липидпереносящими белками, которые катализируют обмен. Эти белки чаще всего выделяют из тканей млекопитающих. Наиболее изучен белок из печени крысы, который обладает абсолютной специфичностью по отношению к фосфатидилхолину и катализирует его обмен между мембранами. Большинство других липидперенося-щих белков менее специфичны к полярным головкам липидных молекул. Это растворимые белки, которые имеют высокоаффинные места связывания фосфолипидных молекул. Механизм обмена неизвестен, однако ЛПБ можно использовать для изучения липидной асимметрии, поскольку они связывают липиды только наружной поверхности бислоя, с которыми они контактируют. Обычно мембранные везикулы инкубируют с избытком липосом, содержащих радиоактивно меченный фосфолипид, в присутствии липидперенося-щего белка. Фосфолипидный обмен со стехиометрией 1:1, который катализируется указанными белками, не приводит к изменению состава мембран, при этом степень обмениваемости фосфолипидов можно определить, измерив удельную радиоактивность мембраны. Если фосфолипид в мембране полностью доступен для обмена, то его удельная радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой. Если же изучаемый липид на внутренней стороне мембраны недоступен для обмена, то его удельная радиоактивность в мембране будет ниже, чем в липосомах. Если трансмембранная миграция протекает медленнее, чем устанавливается равновесие при обмене, то удельная радиоактивность будет возрастать во времени, и это возрастание будет отражать скорость флип-флопа. При проведении этих экспериментов необходимо отделять липосомы от изучаемых мембран; для этого обычно используют центрифугирование.

Достоинство этой методики состоит в том, что ЛПБ не проникают через мембрану, недостаток же связан с тем, что равновесие устанавливается медленно, за несколько часов или даже больше. Поэтому данная методика неприменима, когда происходит быстрая трансмембранная миграция, но ее можно использовать в сочетании с другими методами. Например, можно провести обмен радиоактивных липидов, находящихся на наружной поверхности бислоя, а затем использовать фосфолипазы для оценки скорости, с которой эти липи-ды мигрируют с наружной стороны мембраны на внутреннюю.

Фосфолипазы

Фосфолипазы — это ферменты, гидролизующие фосфолипиды по связям, указанным на рис. 4.3. Фосфолипазы представляют собой

растворимые белки, которые взаимодействуют только с наружной поверхностью бислоя и поэтому являются ценным инструментом для изучения асимметрии фосфолипидов и скорости их трансмембранной миграции. При работе с фосфолипазами следует иметь в виду два момента: 1) не все фосфолипиды на наружной стороне мембраны легко вступают в реакцию; 2) продукты реакции обычно дестабилизируют бислой. Даже если при действии фосфолипаз целостность бислоя не нарушается, скорость трансмембранной миграции фосфолипидов может существенно возрасти. Поэтому ход реакции необходимо тщательно контролировать, а выводы, сделанные на основании полученных результатов, — критически анализировать.

Другие методы

Для установления трансмембранного распределения липидов были предложены и другие специальные методы. Рассмотрим некоторые из них.

1. Распределение кардиолипина можно определить по специфичному связыванию с ним адриамицина.

2. Распределение гликолипидов можно определить, окисляя их либо галактозооксидазой, либо периодатом натрия с последующим восстановлением ³Н-боргидридом натрия.

3. Распределение стеролов можно определить несколькими методами. Стеролы могут самопроизвольно обмениваться между мембранами даже без участия особых белков. Поэтому их присутствие в наружном монослое мембраны можно определить по переносу в липосомы или из липосом. Распределение холестерола между двумя сторонами мембраны устанавливали, изучая кинетику образования комплекса между ним и филипином. Наконец, для определения содержания холестерола в наружном монослое мембраны использовали холестеролоксидазу, однако возникающие при этом артефакты ставят возможность применения этого фермента под сомнение.

ПРИМЕРЫ ЛИПИДНОЙ АСИММЕТРИИ

Из-за экспериментальных трудностей, связанных с определением липидной асимметрии, можно привести лишь несколько примеров, в которых асимметрия несомненно доказана. Прежде всего следует упомянуть эритроциты человека, которые в этом отношении были, детально изучены, причем все использованные методы дали хорошо согласующиеся между собой результаты. Другой пример такого рода — это высокая степень асимметрии наружной мембраны грамот-рицательных бактерий; впрочем, эта мембрана необычна в том отношении, что ее основным компонентом является уникальный липо-полисахарид. Нет никаких сомнений, что асимметричное распределение липидов свойственно и другим биологическим мембранам, однако убедительные данные получены лишь в немногих случаях.

Липидная асимметрия в фосфолипидиых везикулах

Для малых моноламеллярных везикул, состоящих из двух разных липидов, характерно асимметричное распределение липидов. Например, в везикулах, состоящих из смеси фосфатидилхолина с другими липидами, наружный монослой обогащен сфингомиелином или фосфатидилглицеролом, а фосфати-дилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфа-тидная кислота предпочитают находиться на внутренней поверхности. Общепризнано, что в этих случаях липидная асимметрия возникает прежде всего из-за различий в упаковке молекул на двух сторонах бислоя ММВ. Липиды с более объемными полярными головками стремятся находиться в наружном монослое, потому что там больше площадь поверхности, приходящейся на молекулу. Однако биологические мембраны, за отдельными исключениями, не имеют участков со столь большой кривизной, так что эти выводы нельзя безоговорочно распространить на любые биологические мембраны. С помощью трансмембранного градиента рН липидную асимметрию можно индуцировать и в больших моноламеллярных везикулах.

Липидная асимметрия в эритроцитах человека

Четко показано, что распределение липидов в мембране эритроцитов в высшей степени асимметрично. Как видно из рис. 4.4, фосфа-тидилхолин и сфингомиелин находятся преимущественно в наружном монослое, тогда как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсе-рин — в основном во внутреннем.

Имеются убедительные данные о том, что для сохранения липидной асимметрии необходима целостность цитоскелета. Она нарушена в клетках, дефицитных по спектрину или белку полосы 4.1. Воздействия, нарушающие цитоскелет, изменяют и липидную асимметрию, хотя неясно, являются ли эти эффекты прямым следствием повреждения цитоскелета. Кроме того, в малых везикулах, полученных из мембраны эритроцитов, распределение липидов менее асимметрично. Эти данные показывают, что цитоскелет играет определенную роль в поддержании липидной асимметрии. Механизм такого влияния неясен, однако можно предположить, что имеет место прямое связывание цитоске-летных белков с аминофосфолипидами.

Прямая стабилизация асимметрии, если она существует, — это только одна сторона вопроса. Так, экзогенные фосфолипиды, включенные в мембрану эритроцитов с помощью обменивающих белков, примерно через сутки перераспределяются, и их асимметрия принимает такой же характер, как и у эндогенных липидов. На рис. 4.5 приведена схема этих экспериментов. Измеряя кинетику гидролиза под действием фосфолипаз, можно определить скорость флип-флопа липидных молекул. Эта скорость возрастает в ряду фосфатидилсерин > фосфатидилэтаноламин > фосфатидил-холин > сфиигомиелии. Подобные результаты были получены с помощью спин-мечеиных липидов и лизофосфолипидов. Таким образом, те липиды, которые локализуются на внутренней стороне мембраны, имеют и относительно большую скорость транс-мембраииой миграции. Те же липиды, которые находятся на наружной стороне, мигрируют значительно медленнее либо вообще не совершают флип-флоп-перескоков.