11032 (Искусственный синтез олигонуклеотидов), страница 2

По заданной программе механический привод за 1 секунду переносит иглу и кольцо в положение точно над очередной лункой плашки. Торец иглы во время этого переноса поднимается выше кольца. Затем кольцо мгновенно опускается в лунку. Благодаря малому диаметру кольца жидкость образует в его плоскости устойчивую пленку. Затем, также за 1 секунду, каретка переносит иглу с кольцом в заданное положение над одним из предметных стекол — с точностью в ±10 микрон! Сухой стержень иглы опускается, пронизывает пленку, смачивается и с легким ударом (пружинка!) касается своим торцом стекла. Жидкость с него стряхивается. На поверхности стекла образуется крошечная капля, диаметром 0,3 мм, которая не растекается благодаря гидрофобности покрытия на стекле.

Затем игла и кольцо так же быстро переносятся в положение над колодцем с водой и опускаются в него. Одновременно включается насосик, кольцо и игла энергично споласкиваются. Затем они точно так же переносятся в колодец с этанолом, потом в сушильную камеру... Через примерно 5 секунд после начала серии описанных операций игла и кольцо вновь оказываются уже над другой лункой (согласно программе) и все повторяется снова. Легко подсчитать, что для раскапывания всех наших 256-ти проб потребуется не больше 25-ти минут. Интервалы между каплями на стекле равны 0,2 мм. Таким образом, на площади квадрата со стороной 8 мм разместятся все наши олигонуклеотидные «зонды», как их принято называть. (Если бы их было две тысячи, то пришлось бы занять все восемь предметных стекол, а на раскапывание прибор потратил бы немногим более 3-х часов.)

Такая экономия места на стекле (8х8 мм) нужна для того, чтобы все 256 капель поместились в поле зрения бинокулярной лупы (для визуального контроля качества нанесения), а затем перед экраном передающей телевизионной камеры, связанной с компьютером и его монитором.

Описанный прибор (марки GMS-417 Arrayer) появился на рынке сравнительно недавно (в 1998 году) и пока не получил лучшего названия, чем «ЧИП-прибор». Chip в английском языке обозначает стружку, тонкий кусочек. Отсюда и весьма ценимые молодежью картофельные «Чипсы» и «чипы» в микроэлектронике — крошечные пластинки, на которых размещаются тысячи транзисторов. Вообще, разительные успехи технологии электронной промышленности оказали огромное влияние на совершенствование современной научно-исследовательской аппаратуры.

Об этом еще ярче свидетельствует принцип устройства нового прибора того же назначения, что описанный. В нем синтез олигонуклеотидных зондов ведется прямо на стекле под управлением лазерного луча. (Такая возможность была упомянута при изложении идеи химического синтеза олигонуклеотидов.) Утверждается, что с использованием этого метода на площади в 1 квадратный сантиметр можно разместить миллион зондов!

Но вернемся к нашему опыту. Дальнейшая обработка капель на предметном стекле происходит вне ЧИП-прибора. Стекло переносят в камеру для облучения ультрафиолетовым светом. Под его воздействием полимеризуется и «пришивается» к стеклу полиак-риламидный гель. В нем оказываются заполимеризованы и олиго-нуклеотиды. Однако благодаря крупнопористости геля значительная их часть остается доступной для гибридизации. Гель подсушивается.

К молекулам всех иРНК предварительно химически, к концу цепи прикрепляется флюоресцентная метка. Затем стекло покрывают тонким слоем раствора, содержащего смесь всех меченых таким образом иРНК. Выдерживают в условиях, благоприятных для гибридизации. Потом отмывают от всех иРНК, не связавшихся с зондами. Только молекулы нужной иРНК «отыщут» в одной из бывших капель олигонуклеотиды, которые точно соответствуют одному из участков генома, кодировавшего интересующий нас белок. По флюоресценции под действием лазерного луча соответствующую каплю с севшими на нее молекулами иРНК зафиксирует объектив телевизионной камеры. Компьютер укажет их координаты и покажет светящуюся точку на экране монитора.

После чего найденную таким образом иРНК можно освободить из гибрида и использовать для получения кДНК, как это было описано выше. Таким образом задача, обозначенная первой в начале этой главы, решена. Не беда, если количество полученной таким образом кДНК окажется недостаточным для того, чтобы обеспечить весь последующий эксперимент, начинающийся со встраивания в плазмиду. Есть относительно простой способ многократно увеличить это количество по полученному образцу.

Литература

1. Душкин М.П., Иванова М.В. Трансформация перитонических макрофагов в пенистые клетки при внутрибрюшном введении мышам липопротеидов низкой плотности, холестерина и его продуктов окисления. // Патофизиология и эксперимент. терапия. -1993. -N 2. -С.9-11.

2. Дятловская Э.В., Безуглов В.В. Липиды как биоэффекторы. Биохимия. 1998. Т. 67. вып. 1.-С.-3-6.

3. Ершова Л.П., Курбанова Г.Н., Горбунова Н.А. О механизмах посттравматической анемии. // Пат.физиология. 1992. -N 2.-С.-54-55.