9949 (Комбинированное действие солей тория)

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации

Сыктывкарский государственный университет

Химико-биологический факультет

Кафедра физиологии человека и животных

Допустить к защите:

зав. кафедрой

д.б.н., проф.

_____________В.Г. Зайнулин

Дипломная работа

Комбинированное действие солей тория,

свинца и гамма-излучения на

мужские половые клетки

лабораторных мышей

Научный руководитель:

с.н.с., к.б.н. _____________ А.О. Ракин

Исполнитель:

студентка 153 группы ______________ М.С. Фисуп

Сыктывкар 2000

Содержание

Краткие обозначения:

ИИ – ионизирующее излучение

ДЛМ – доминантные летальные мутации

ПЛМ – поздние летальные мутации

РЛМ – ранние летальные мутации

АГС – аномалии головок спермиев

ТМ – тяжелые металлы

Введение

В последнее время остро стоит проблема биологической опасности и, в частности, генетической эффективности малых доз мутагенов. До сих пор не существует единого мнения о наличии или отсутствии «пороговой дозы», хотя факт «пороговой чувствительности клетки» не оспаривается практически никем. При этом наибольшую проблему в разрешении данной задачи представляет взаимная «интерференция» трех отправных точек при формировании генетического эффекта: мощности дозы, времени воздействия мутагена и состояния генотипа. Т.о. зависимость «доза-время-эффект» (Бурлакова, 1994) усложняется даже на предварительном этапе оценки влияния малых доз на биологические объекты, особенно если речь идет о природных популяциях. Не для кого не секрет, что именно малые дозы, в особенности ионизирующие излучения (ИИ), являются источником накопления генетического груза, ведущего к качественным изменениям в генетической структуре популяции и, в итоге, к осуществлению микроэволюционных событий.

Нельзя не обратить внимание и на характер биологического действия мутагена, т.е. на критерий оценки его влияния на организм - физический или химический. Если ИИ, в частности γ-излучение - чисто физический фактор, а тяжелые металлы (ТМ) - химический, то безусловно смешанным действием обладают тяжелые естественные радионуклиды (ТЕРН). Причем генетичес- кий эффект внутреннего облучения, который демонстрируют ТЕРН значительно превышает таковой от внешних источников ИИ при равных поглощенных дозах (Дубинин, 1978; Кузин, 1991 и др.).

Наконец, поскольку эти факторы в природе практически не встречаются и не взаимодействуют в «чистом» виде, то необходимо дать оценку их влияния на живые объекты в сочетаниях друг с другом. К тому же сведения о комплексном действии ТМ, ТЕРН и ИИ в малых дозах крайне скудны.

Генетическая опасность ТМ и ТЕРН, в отличие от токсической, изучена на сегодняшний день недостаточно, и результаты такого рода исследований довольно противоречивы. Особенно мало данных по влиянию этих веществ на генеративные клетки и ткани, отвечающие за возрастание эмбриональной смертности и, особенно, за накопление генетического груза в популяциях. Поэтому несомненную важность приобретают исследования генотоксического действия ТМ, ТЕРН и ИИ на гаметогенез, в особенности на процесс формирования мужских половых клеток как значительно более уязвимых для мутагенных воздействий.

Поскольку в природе в основном приходится сталкиваться с низким и умеренным содержанием ТМ, ТЕРН и ИИ, то при проведении модельных экспериментов по исследованию их генотоксического гонадотропного действия особый интерес вызывает влияние концентраций этих веществ на 1-2 порядка ниже полулетальной дозы для млекопитающих (Левина, 1972), а пролонгированного γ -излучения - на 2-3 порядка (Кузин, 1991). Наиболее популярным объектом в такого рода исследованиях являются лабораторные млекопитающие чистых линий, генетический полиморфизм в лабораторных популяциях сведен к минимуму.

В настоящей работе предпринята попытка исследовать генотоксическое действие свинца и тория (в виде водных растворов нитрата) и пролонгированного γ-облучения малой мощности при формировании сперматогоний и ранних сперматоцитов у самцов мышей линии СВА генетическим и цитогенетическим методами. Таким образом нами изучалась чувствительность половых клеток, находящихся на ранних стадиях сперматогенеза к перечисленным мутагенам в «субвитальных» дозах и концентрациях.

1. Обзор литературы

1.1 Действие ионизирующего излучения на наследственные структуры

ИИ обладает сильным мутагенным эффектом. Для мутагенного действия наследственный материал является главной мишенью. Нарушение структурной организации приводит к изменениям в потомстве данного организм, либо к его гибели. Существуют гипотезы о возникновении генетических перестроек. К примеру, физиологическая гипотеза предполагает возникновение мутаций не в фазе непосредственного повреждения генетического аппарата, но при нетождественной репарации. (Лобашов, 1947). Предложенная В.И. Корогодиным (1966) гипотеза основывается на предложении, что результат внешнего воздействия - потенциальные повреждения наследственных структур, переходящие в истинные.

Первичные повреждения наследственного материала, вызванные ИИ, заключаются в одно- и двунитевых разрывах глюкозидной связи с последующим удалением оснований из полимерной ДНК; образующиеся деструктивные основания, «апуриновые, амидопириповые участки могут служить субстратом для специфических эндонуклиаз. Азотные основания повреждаются в два - три чаще, чем однонитеевые разрывы фосфодиэфирных связей. В свою очередь однотиевые разрывы формируются на 1-1,5 порядка чаще, чем двунитевые (Жестяников, 1979). Наиболее радиоустойчивы - нуклиазидные связи в нуклеиновых кислотах, они в 7-9 раз стабильнее, чем фосфодиэфирные (Кузин, 1973).

Согласно теории Д. Кроузера (Ли, 1963) первичным актом является попадание кванта энергии в определенную структуру, и ионизация, вызывающая повреждение, возникает именно в ней. Однако после открытия репарационных ферментных систем стали очевидны возможности возникновения скрытых повреждений. которые не всегда завершаются проявлением адекватного радиогенетического эффекта (Корогодин. 1966).

Структурно-метаболическая теория предвидит возможность, когда в следствие радиохимических процессов в ядре клетки формируются вещества, вызывающие повреждение структур ДНК и ДНП (Кузин, 1973).

В конечном итоге, повреждения формируются в несгабильной структуре, исход которых может быть либо возникновением точковых мутаций и формирование хромосомных аберраций, либо первичные изменения могут быть репарированы. При чем зависимость выхода точковых и хромосомных мутаций обусловлена различными механизмами возникновения этих двух типов мутаций. Например, различная мощность дозы не влияет на выход точковых мутаций у дрозофилы, в то время, как уровень аберрантных перестроек увеличивался пропорционально увеличению мощности дозы гамма-облучения. Сходные результаты при обработке линейных мышей рентгеновскими лучами получили П. Буул и Дж. Гудзварт (Buul, Goudzwart 1986, цирк. по Ракину).

В частности, наличие гена, нарушающего рекомбинацию, под влиянием гамма лучей не вызывала увеличения частоты РЛМ у дрозофилы, хотя выход гиперплоидных самцов при этом был различен (Miyamoto, 1983, цит, по Ракину).

На выраженность радиогенетического эффекта может влиять митотическая активность клетки. Чем больше времени проходит между делениями клетки, тем больше событий аберрантной природы (Gaulden, Weber, 1984, цирк. по Ракину).

Безусловно и то, что индукция хромосомных аберраций зависит от дифференцировки клеток. Большая резистентность больших лимфоцитов по сравнению с малыми объясняется тем, что у последних в процессе дифференциации сильно возрастает плотность спирализации ДНК, что ведет к утрате способности к эксцизионной репарации (George e.a.; 1987, цит. по Ракину).

Неодинакова радиочувствительность клеток различных тканей одного и того же организма. Это четко показал И. Буул при сравнении реакции на облучение сперматоцитов и клеток костного мозга мышей, в последних образуется в 4,5 раза больше аберраций, чем в половых клетках. Аналогична картина и при сравнении сперматоцитов и клеток роговицы глаза мыши. Такое несоответствие можно объяснить различной активностью репаративных энзимов в тканях выполняющих различные функции. Частота возникновения аберрантных перестроек в одной о той же хромосоме и негомологичных парах хромосом одного генома то же различна.

Выход хромосомных аберраций может зависеть от параметров, таких, как пол особи (Ватти, 1987), возраст, физиологическим состоянием клетки и организма в целом. Однако хромосомные аберрации могут возникать и без прямого воздействия ИИ за счет дестабилизации цепи ДНК, индуцированной в результате потери или модификации нуклеотидов, либо образование ДНК-межнитевых сшивок чипа димеров тимина (Liu, Heddle, 1981, цит. по Ракину).

На основании этих фактов можно предположить, что при действии ИИ на ДНК, первичные реакции начинаются с повреждения азотных оснований. В последствие нерепарируемые повреждения фиксируются в виде точковых мутаций, а другая часть поломок вследствие работы репаративных систем преобразуется в хромосомные перестройки.

1. Действие малых доз ионизирующего излучения на

биологические объекты

Хроническое действие малых доз ИИ на организм также опасно, как и однократное воздействие мега-дозы излучения. Анализ данных о выходах генетических повреждений показывает «немонотонную» зависимость выхода мутаций от дозы радиации (Зайнуллин, 1998). Например, частота хромосомных аберраций в корневой меристеме прорастающих семян овсянницы луговой, собранных с гамма - поля, оказалась выше по сравнению с контролем, а однако эта зависимость не всегда была монотонной. Частота хлорофильных мутаций среди всходов облучившихся семян, напротив оказалась ниже контрольного уровня. Это может быть связано, как с высоким полиморфизмом данного показателя, типичным для дикорастущих видов, так и с явлением гомозиготации в малых изолированных популяциях (гамма - поле) (Зайнуллин, 1993).

Исследуя линии дрозофил спонтанный уровень доминантных леталий может колебаться (Ватти, 19б5). При относительно низком фоне радиации обнаруживается повышение уровней доминантных леталий (Шевченко, Померанцева 1985).

Хроническое облучение в алых дозах приводит к заметному изменению величины генетического груза. Наряду с увеличением частоты мутаций (летальных, полулетальных) снижающих жизнеспособность, возможно увеличение доли супервитальных мутаций, приводящих к повышению жизнеспособности.

При излучении реакции мышевидных грызунов на хроническое облучение в малых днях показано, что в большинстве случаев характер зависимости «доза - эффект» имеет нелинейных характер и во многом определяется генотипом животного. Это можно наблюдать на полевке-экономке (со стабильным генотипом) виварского содержания, мышевидных грызунов из зоны сильно загрязненной (Зайнуллин, 1998).

Частота выхода мутаций может быть обусловлена разной радиочувствительностью клеток (соматических и половых), а также активностью репарационных систем, стабильностью генома, физиологическим состоянием организма (Шевченко, 199б, Померанцева, 1969).

УФ - лучи и органические перекиси вызывают мутации нуклеиновых кислот (Ауэрбах, 1978).

Существует ряд химических агентов, получивших название «супермутагенов», к которым относятся пестицды, этилметасульфонат, этиленамин и другие (Шварцман, 1973). В сочетании ИИ и супермутагены проявляют либо аддитивный либо синергический эффект, противоположным по действию являются радиопртекторы. Их действие основано на перехвате кванта энергии, электронов, либо образующегося в результате их действия свободного радикала. К этим веществам относятся тиолсодержащие соединения, витамины тиамин и цианобеламин, иденовые соединения. Радиопртекторы снижают вероятность формирования летальных повреждений и уже сформированных потенциально летальных повреждений в следствие стимуляции систем пострадиационного восстановления.

1.1.2. Биологическое действие гамма-излучения

Гамма - лучи, возникают в результате радиоактивного распада атомных ядер. Они обладают высокой энергией и могут проникать в ткани. При этом они сталкиваются с атомами, вызывают высвобождение электронов и образование позитивно - заряженных свободных радикалов или ионов. Эти заряженные частицы сталкиваются с другими молекулами, что влечет за собой высвобождение новых электронов. Поэтому вдоль трека высоко - энергетического луча формируется стержень ионов, проходящий в живые ткани. Такая трансформация электронной сети вызывает изменения различных структур в клетке, в частности мембранного комплекса, органелл и ДНК.