starenie (Старение на клеточном уровне), страница 2

Не исключено, что во всех этих событиях роковую роль играют митохондрии. Именно в митохондриях генерируется больше всего супероксида, причём этот процесс может приобретать характер саморазгоняющегося. Чем больше образуется супероксида, тем больше вероятность повреждения митохондриальной ДНК. Повреждение митохондриальной ДНК ведёт к нарушению синтеза белков — переносчиков электронов дыхательной цепи. Торможение дыхательной цепи приводит к генерации ещё большего количества супероксида. Таким образом, может возникнуть угроза уничтожения ядерной ДНК и клетки в целом.

Нарастание продукции АФК с возрастом — твёрдо установленный факт. Помимо повреждения ДНК этот эффект может отражаться и на белках. Увеличение окислительной денатурации белков усугубляется тем, что при старении такая денатурация уже не может полностью компенсироваться индукцией белков теплового шока.

Теломеры.

Теломерами называют особые концевые районы линейной хромосомной ДНК, состоящие из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей. В состав теломер входят также многие белки, специфически связывающиеся с теломерными ДНК-повторами. Таким образом, теломеры (так же, как и все другие районы хромосомы эукариот) построены из дезоксинуклеопротеидов, то есть комплексов ДНК с белками.

Существование специальных структур на концах хромосом было окончательно доказано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелевской премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером. Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. Следовательно, заключили они, естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами. Г. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос — конец и мерос — часть).

В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской клетки), но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра), называемой ядерным матриксом (рис. 1,2). Таким образом, теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Более того, наличие на концах хромосом специальной теломерной ДНК позволяет решить так называемую проблему концевой недорепликации ДНК.

Теломерная ДНК (рис. 3,4) попала в поле зрения молекулярных биологов сравнительно недавно, когда были разработаны эффективные методы определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Первыми объектами исследования были одноклеточные простейшие (ресничная инфузория тетрахимена, в частности), поскольку из-за особенностей строения ядерного и хромосомного аппарата они содержат несколько десятков тысяч очень мелких хромосом и, следовательно, множество теломер в одной клетке (для сравнения: у высших эукариот на клетку приходится менее ста теломер).

Многократно повторяющиеся блоки в теломерной ДНК простейших состоят всего лишь из шести—восьми нуклеотидных остатков. При этом одна цепь ДНК сильно обогащена остатками гуаниловой кислоты (G-богатая цепь; у тетрахимены она построена из блоков TTGGGG (2 тимин- 4 гуанин)), а комплементарная ей цепь ДНК соответственно обогащена остатками цитидиловой кислоты (С-богатая цепь).

У дрожжей повторяющиеся блоки в теломерной ДНК заметно длиннее, чем у простейших, и зачастую не столь регулярные. Каково же было удивление ученых, когда оказалось, что теломерная ДНК человека построена из TTAGGG-блоков (2 тимин-аденин-3 гуанин), то есть отличается от простейших всего лишь одной буквой в повторе. Более того, из TTAGGG-блоков построены теломерные ДНК (вернее, их G-богатые цепи) всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб. Столь же универсален теломерный ДНК-повтор у растений: не только у всех наземных растений, но даже у их весьма отдаленных родственников —морских водорослей он представлен последовательностью TTTAGGG (3 тимин-аденин-3 гуанин). Впрочем, удивляться здесь особенно нечему, так как в теломерной ДНК не закодировано никаких белков (она не содержит генов), а у всех организмов теломеры выполняют универсальные функции, речь о которых шла выше. Правда, из этого общего правила есть редкие исключения. Наиболее известное из них — теломерная ДНК плодовой мухи дрозофилы. Она представлена не короткими повторами, а ретротранспозонами — подвижными генетическими элементами.

Очень важная характеристика теломерных ДНК — их длина. У человека она колеблется от 2 до 20 тыс. пар оснований (т.п.о.), а у некоторых видов мышей может достигать сотен т.п.о.

Известно, что около теломер есть специальные белки, обеспечивающие их работу и участвующие в построении теломер. Доказано, что для нормального функционирования каждая линейная ДНК должна иметь две теломеры: по одной теломере на каждый конец.

Концевая недорепликация ДНК.

Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3'-конца к 5'-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5' → 3'. В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может (рис. 5). Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера — короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Однако на 3'-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому 3'-концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки — недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что прежде всего должна сокращаться длина теломерной ДНК.

Этим-то и объясняется «лимит Хейфлика», так как после того, как длина теломерной ДНК становится угрожающе низкой, наступает период кризиса — неспособности клетки к дальнейшему делению, а затем и её смерть. Хотя в культурах клеток in vitro клетки и погибают от укорочения теломер, но для клеток in vivo нормального организма это практически невозможно. Так, согласно недавним наблюдениям Озавы (см. Ozawa, T., Biosci. Rep. (1997) in press) 89% митохондриальной ДНК в митохондриях сердца 97-летнего старика содержали обширные делеции, критичные для репликации и транскрипции. Тем не менее, этот человек умер не от сердечной недостаточности, а от рака желудка. Нетрудно представить себе, что дальнейшее нарастание дисфункции митохондриальной ДНК всё же привело бы старика в недалёком будущем к смерти и это вряд ли имело отношение к укорочению ядерной ДНК.

Первым на проблему "концевой недорепликации ДНК" обратил внимание А.М. Оловников в 1971 году. Он высказал гипотезу о том, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Предполагалось, что процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал "смертной" клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. А.М. Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК.

Гипотеза А.М. Оловникова нашла убедительное подтверждение в последующие годы. Во-первых, было установлено, что теломеры нормальных (то есть обреченных на старение) клеток действительно укорачиваются на 50-60 нуклеотидных звеньев при каждом клеточном делении. Во-вторых, в 1984 году Э. Блэкберн и Э. Грайдер выделили фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент был назван, теломеразой.

Как работает теломераза.

Итак, основное назначение теломеразы — синтезировать повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК. Таким образом, она относится к классу ДНК-полимераз, причем оказалось, что теломераза — это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, очень хорошо известны молекулярным биологам. Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем заболевание СПИДом) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах.

РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длине и структуре. Теломеразы простейших содержат РНК длиной в 150—200 нуклеотидных остатков (н.о.), длина теломеразной РНК человека — 450 н.о., в то время как теломераза дрожжей содержит аномально длинную РНК (около 1300 н. о.).

Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он комплементарен.

Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3'-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения, по-видимому, служит сама реакция синтеза цепи теломерной ДНК, поскольку дезоксинуклеозидтрифосфаты — субстраты этой реакции — высокоэнергетические вещества.

На рис. 6 изображена общепринятая схема механизма синтеза теломерных повторов, катализируемого теломеразой. На первой стадии теломераза находит 3'-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует 3'-конец хромосомной ДНК в качестве праймера. Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы. Она обеспечивается специальной субъединицей теломеразы, которая по устройству своего каталитического центра во многом сходна с обратными транскриптазами ретровирусов и ретротранспозонов. Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь.

Это схематичное представление является весьма условным, так как для построения теломер требуется еще много субъединиц, например, отвечающих за нахождение 3’-конца ДНК, или субъединицы, отвечающие за транслокацию, и т.д.

Теломераза, рак и старение.

Рассмотрим данные о длине теломерной ДНК и активности теломеразы в различных клетках человека, приведенные в таблице.

Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всей его жизни. Соответственно их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат все необходимые белки для нормальной репликации клеток.

Аналогичная ситуация наблюдается и для стволовых клеток, которые делятся неограниченно долго. Однако у стволовой клетки всегда есть возможность дать две дочерние клетки, одна из которых останется стволовой ("бессмертной"), а другая вступит в процесс дифференцировки. Благодаря этому стволовые клетки служат постоянным источником разнообразных клеток организма. Например, стволовые клетки костного мозга дают начало гемопоэзу — процессу образования клеток крови, а из базальных клеток эпидермиса происходят разнообразные клетки кожного покрова. Как только потомки половых или стволовых клеток начинают дифференцироваться, активность теломеразы падает и их теломеры начинают укорачиваться. В клетках, дифференцировка которых завершена, активность теломеразы падает до нуля, и с каждым клеточным делением они с неизбежностью приближаются к состоянию сенесенса (перестают делиться). Вслед за этим наступает кризис, и большинство клеток погибают (рис. 7). Эта картина характерна для подавляющего большинства известных культур клеток эукариот. Одна­ко и здесь есть редкие, но важные исключения: теломеразная активность обнаруживается в таких "смертных" клетках, как макрофаги и лейкоциты.

Недавно было установлено, что нормальные соматические клетки потому лишены теломеразной активности, что в них полностью подавлена экспрессия гена ее каталитической субъединицы (обратной транскриптазы). Другие же составляющие теломеразы, включая теломеразную РНК, образуются в этих клетках, хотя и в меньших количествах, чем в их "бессмертных" прародителях, но постоянно. Открытие этого важного факта Дж. Шеем, В. Райтом и их сотрудниками и стало основой для сенсационной работы по преодолению «лимита Хейфлика».

Искусственное преодоление «лимита Хейфлика».

Итак, достаточно недавно Дж. Шей и В. Райт провели сенсационную работу по преодолению «лимита Хейфлика». В нормальные соматические клетки были внесены гены теломеразной обратной транскриптазы с помощью специальных векторов, сконструированных из вирусных ДНК. Уровень экспрессии гена в эукариотической клетке зависит от многих факторов, в том числе от белков — факторов транскрипции, связывающихся со специализированными участками ДНК, расположенными в хромосоме по соседству с этим геном. Геномы вирусов, которым нужно быстро размножиться в клетке-хозяине, несут в себе участки ДНК, способные во много раз усилить экспрессию того или иного гена. Исследователи позаботились о том, чтобы в их конструкциях ген теломеразной обратной транскриптазы человека оказался в окружении именно таких участков вирусной ДНК. Результаты их экспериментов можно определить так: клетки, в которых теломераза поддерживала длину теломер на уровне, характерном для молодых клеток, продолжали делиться и тогда, когда контрольные клетки (без теломеразы) дряхлели и умирали.

В этой и аналогичной ей работах особенно тщательно контролируется отсутствие в культуре раковых клеток. Известно, что клетки большинства исследованных на сегодня раковых опухолей характеризуются достаточно высокой активностью теломеразы, которая поддерживает длину теломер на постоянном уровне. Этот уровень заметно ниже, чем, например, у эмбриональных клеток, но он достаточен, чтобы обеспечить безграничное деление раковых клеток в культуре. Существует гипотеза, у которой немало сторонников, предполагающая, что потеря теломеразной активности соматическими клетками современных организмов есть благоприобретенное в процессе эволюции свойство, уберегающее их от злокачественного перерождения.

Сравнительно небольшая длина теломер у большинства раковых клеток наводит на мысль о том, что они происходят из нормальных клеток, достигнувших предкризисного состояния. Это состояние характеризуется нарушением регуляции многих биохимических реакций. В таких клетках происходят многочисленные хромосомные перестройки, которые в том числе ведут и к злокачественной трансформации. Большинство этих клеток погибают, но в части из них в результате случайных мутаций может активироваться постоянная экспрессия генов теломеразы, которая будет поддерживать длину теломер на уровне, необходимом и достаточном для их функционирования.

Некоторое время вызывал недоумение тот факт, что примерно пятая часть проанализированных раковых опухолей и клеток вообще не содержала активной теломеразы. Оказалось, однако, что длина теломер в них поддерживается на должном уровне. Таким образом, в этих клетках действует другой (не теломеразный, а скорее рекомбинационный) механизм образования теломерной ДНК. Иными словами, такие клетки находятся в том же ряду исключений из правила, что и дрозофила.