KLONS (Клонирование), страница 2

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследователи Стик и Робл, используя методику МакГрата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа. Скудность данных, видимо, и связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные данные.)

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента (рис. 4). Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы, прежде всего, связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Но вернёмся к клонированию человека. Существует несколько способов обойти этические проблемы – выращивать отдельные органы из клеток реципиента или использовать животных. Но это только "косметический" метод. Реальный шаг к бессмертию - искусственное изменение ДНК. В июне 2000 года  и случилось то, чего так долго ждали и чего некоторые так боялись. Появилось сообщение, что ученым из уже знаменитой своей овцой Долли шотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Института в Эдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек с измененной ДНК.  Шотландские ученые смогли осуществить клонирование, при котором генетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону. Однако именно этого, генетического вмешательства и боятся многие противники клонирования.

Хотя существует и уже  узаконенный путь обхода запрета на клонирование человека, который называется "терапевтическое" клонирование человеческих существ. Речь идет о создании ранних эмбрионов - своего рода банка донорских тканей для конкретных индивидуумов. Именно используя его, американская компания Advanced Cell Technology Inc. (ACT, город Вустер, штат Массачусетс) объявила в ноябре 2001 года об успешном клонировании человеческого эмбриона. 

Интересно отметить, что эта компания в октябре получила правительственный грант  1.8 млн. $ на проведение исследований в области биотехнологии. Порадовала и  реакция конкурентов: "Я очень рада, что мы не одиноки. Мы получаем эмбрионы каждый день", - заявила директор Clonaid Бриджит Боселье (Brigitte Boisselier).

Для эксперимента учёные использовали в общей сложности 17 женских яйцеклеток: удалив из них ядра, они внедрили на их место ядра, позаимствованные из клеток кожи взрослого человека. В трёх яйцеклетках начался нормальный процесс роста и деления. Когда эмбрионы состояли из 6-ти клеток каждый, учёные прервали их дальнейшее развитие с тем, чтобы использовать полученные клетки для дальнейших исследований.

Следует отметить, что стволовые клетки, которые, собственно, и являются предметом интереса ученых, занимающихся исследованиями в области терапевтического клонирования, можно выделить только из эмбриона, в своем развитии достигшего стадии бластоцисты (около сотни клеток). Однако специалисты ACT заявляют, что созданные ими, в другом эксперименте,  обезьяньи зародыши развились до стадии бластоцисты. Из эмбрионов были выделены стволовые клетки, которые в ходе их специализации удалось превратить в нейроны. Сообщается, что эти нейроны оказались в состоянии вырабатывать допамин и серотонин - два важнейших гормона, которые вырабатываются мозгом.

В интервью CNN президент компании ACT доктор Майкл Вест сказал, что его компания не заинтересована в клонировании людей, и что она не создавала эмбрион человека для репродуктивных целей "Мы только хотим помочь больным людям, нуждающимся в помощи, и в этом состоит работа всего нашего центра".

Определение лечебного клонирования человека

Одобрение и разрешение терапевтического клонирования человека основывалось на морально-этическом различии между "репродуктивным" и "терапевтическим" клонированием. Репродуктивное клонирование - это воспроизведение всего человеческого организма целиком. Лечебное же (медицинское, терапевтическое) клонирование по определению прекращает копирование человеческих клонов на эмбриональной стадии и не допускает имплантации и нормальной беременности. При терапевтическом клонировании эмбрион разрушают на ранней стадии развития - на стадии бластоцита, и получают из него культуру стволовых клеток. Для получения этой клеточной массы, которая при нормальной беременности дает начало плоду, эмбрион неизбежно следует разрушить. Стволовые клетки человеческого эмбриона называют плюрипотентными стволовыми клетками (ПСК), поскольку они могут давать начало разнообразным типам клеток. В ноябре 1998 года доктор Томсон (Thomson) в Висконсинском университете получил культуру стволовых клеток человеческого эмбриона из зародышей, предоставленных клиниками по искусственному оплодотворению в пробирке - in vitro. Эти клетки были плюрипотентны, то есть обладали большими возможностями, и неограниченно делились в лабораторных условиях. При имплантации под кожу мыши они давали начало клеткам выстилки кишечника, хряща, кости, мышц и эпителия нервной системы.

Открытие способности стволовых клеток эмбриона давать начало другим типам клеток породило веру в их целебные свойства, с помощью которых можно победить едва ли не любую болезнь и избежать старения. Было высказано мнение, что наивысший терапевтический потенциал эмбриональных стволовых клеток в обновлении тканей может быть реализован при их выделении из собственных клеток пациента. Чтобы получить "по заказу" такие индивидуально специфичные ПСК, требуется применить метод переноса ядра соматической клетки (ПЯСК) - этот же метод был использован при клонировании овцы Долли для создания эмбриона, идеально подходящего пациенту. Цель эмбрионального, или терапевтического, клонирования состоит в получении стволовых клеток человеческого эмбриона, идентичных собственным клеткам пациента, что со временем можно будет использовать для лечения болезней. Пока же о стволовых клетках эмбриона известно лишь то, что из них можно получать клетки разных типов, которые способны длительное время существовать в лабораторной культуре. Способности же управлять дифференцировкой и пролиферацией пока остаются на уровне гипотез.
Эмбрион – нечто большее, чем человеческая ткань?
Две крайние точки зрения на ограниченное клонирование отражают две морально-этические позиции по отношению к эмбриону человека. Эмбриолог Уинстон (Winston) утверждает: "Никто не собирается, да и не может клонировать человеческие эмбрионы... Всё, что нам нужно, - получить ткань эмбрионального происхождения и выделить из нее участки клеток, с помощью которых можно будет лечить больных людей". Однако профессор Скэрисбрик (Jack Scarisbrick) говорит иное: "Это - клонирование. Вы создаете точную копию человека. И от этого нового человека отрываете кусок, а потом убиваете его". Почему двое высокообразованных ученых высказывают прямо противоположные мнения об одной и той же методике? Первое мнение отражает биологический подход. Согласно ему, эмбрион, который не прошел имплантацию и внутриутробное развитие, не имеет никаких интересов, которые общество должно защищать. Такой эмбрион - не более чем скопище клеток, управляемых не мозгом, а генетическим кодом. Противоположный подход рассматривает эмбрион как живого человека, которого следует воспринимать как полноценную личность с первого мгновения его существования. "Вопрос не в том, похож ли развивающийся человеческий зародыш на взрослого человека, а в том, соответствует ли его развитие человеческой природе на данной конкретной стадии" (5). Общество обязано защищать человеческий эмбрион в силу его генетической уникальности и способности вырасти в личность. Вот почему эксперименты над эмбрионами - ничем не оправданное убийство.