F₁- АТФаза - это часть большого, пронизывающего всю толщу мембраны комплекса, который состоит по меньшей мере из девяти различных полипептидных цепей. Этот комплекс получил название АТФ-синтетаза; он составляет около 15% всего белка внутренне митохондриальнои мембраны. Весьма сходные АТФ-синтетазы имеются в мембранах хлоропластов и бактерий. Такой белковый комплекс содержит трансмембранные каналы для протонов, и происходит только тогда, когда через эти каналы проходят протоны вниз по своему электрохимическому градиенту.

АТФ-синтетаза может действовать в обратном направлении - расщеплять АТФ и перекачивать протоны. Действие АТФ-синтетазы обратимо: онa способна использовать как энергию гидролиза АТФ для перекачивания протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану, так и энергию потока протонов по электрохимическому градиенту для синтеза АТФ. Таким образом, АТФ-синтетаза - это обратимая сопрягающая система, которая осуществляет взаимопревращение энергии электрохимического протонного градиента и химических связей. Направление ее работы зависит от соотношения между крутизной протонного градиента и локальной величиной G для гидролиза АТФ.

АТФ-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных условиях npoтоннoro градиента, поддерживаемого дыхательной цепью, синтезирует большую часть всего АТФ клетки. Число протонов, необходимое для синтеза одной молекулы АТФ, в точности не известно. При прохождении через АТФ-синтетазу протонов синтезируется одна молекула АТФ.

Как будет работать в данный момент АТФ-синтетаза - в направлении синтеза или гидролиза АТФ, - зависит от точного баланса между изменениями свободной энергии для прохождения трех протонов через мембрану в матрикc и для синтеза АТФ в матриксе. Как уже говорилось, величина G_{синт.АТФ} определяется концентрациями трех веществ в матриксе митохондрии - АТФ, AДФ и Ф_н. При постоянной протонодвижущей силе АТФ-синтетаза будет синтезировать ATФ тех пор, пока отношение АТФ к AДФ и Ф_н не достигнет такого значения, при котором величина G_{синт.АТФ} станет в точности равна +15,2ккaл/мoль. При таких условиях синтез АТФ будет точно уравновешиваться его гидролизом.

Предположим, что в связи с реакциями, требующими затраты энергии, в цитозоле внезапно гидролизовалось большое количество АТФ, и это привело к падению отношения АТФ:AДФ в матриксе митохондрии. В этом случае G_синт. понизится и АТФ-синтетаза вновь переключится на синтез АТФ, пока не восста­новится исходное отношение АТФ:AДФ. Если же протонодвижущая сила внезапно снизится и будет поддерживаться на постоянном уровне, то АТФ-синтетаза начнет расщеплять АТФ, и эта реакция будет продолжаться до тех пор, пока соотношение между концентрациями ATФ и AДФ не достигнет какого-то нового значения (при котором G_{синт.АТФ} = +13,8 ккал/моль), и так далее.

Если АТФ-синтетаза в норме не транспортирует Н⁺ из матрикса, то дыхательная цепь, находящаяся во внутренней митохондриальной мембране, при нормальных условиях переносит через эту мембрану протоны, создавая таким образом электрохимический протонный гра­диент, доставляющий энергию, для синтеза AТФ.

Большинство переносчиков электронов, входящих в состав дыхательной цепи, поглощают свет, и их окисление или восстановление сопровождается изменением цвета. Обычно спектр поглощения и реакционноспособность каждого переносчика достаточно характерны, что позволяет даже в неочищенном экстракте прослеживать изменения его состояний с помощью спектроскопии. Это дало возможность выделить такие переносчики задолго до того, как стала понятна их истинная функция. Например, цитохромы были открыты в 1925 г. как соединения, которые быстро окисляются и восстанавливаются у таких различных организмов, как дрожжи, бактерии и насекомые. Наблюдая клетки и ткани с помощью спектроскопа, удалось идентифицировать три типа цитохромов, которые различались по спектрам поглощения и названы цитохромами а, b и c. Клетки содержат несколько видов цитохромов каждого типа, и классификация по типам не отражает их функцию.

Самый простой переносчик электронов представляет собой неболь­шую гидрофобную молекулу, растворенную в липидном бислое и называемую убихиноном или коферментом Q. Он способен принять или отдать как один, так и два электрона и временно захватывает из среды протон при переносе каждого электрона.

Рисунок 4. Структура убихинона.[10,1993]

Дыхательная цепь содержит три больших ферментных комплекса, встроенных во внутреннюю мембрану

Мембранные белки трудно выделить в виде интактных комплексов,так как они нерастворимы в большинстве водных растворов, а такие вещества, как детергенты и мочевина, необходимые для их солюбилизации, могут нарушать нормальное белок-белковое взаимодействие. Однако в начале 1960-х гг. было обнаружено, что с помощью относительно мягких ионных детергентов, таких как дезоксихолат, можно солюбилизировать некоторые компоненты митохондриальной внутренней мембраны в нативной форме. Это позволило идентифицировать и выделить три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов на пути от НАДH до кислорода.

Рисунок 5. Дыхательные ферментные комплексы.[1,1994]

1. НАДН-дегидрогеназный комплекс - самый большой из дыхательных ферментных комплексов - имеет молекулярную массу свыше 800000 и содержит более 22 полипептидных цепей. Он принимает электроны от НАДH и передает их через флавин и по меньшей мере пять железо-серных центров на_ убихинон - небольшую жирорастворимую молекулу, передаюшую электроны на второй комплекс дыхательных ферментов-комплекс b-c₁.

2. Комплекс b-с₁ состоит по меньшей мере из 8 разных полипептидных цепей и, вероятно, существует в виде димера с молекулярной массой 500000. Каждый мономер содержит три тема, связанных с цитохромами, и железо-серный белок. Комплекс принимает электроны от убихинона и передает цитохрому с, небольшому периферическому мембранному белку, который затем переносит их на цитохром-оксидазный комплекс.

3.Цитохромоксидазный комплекс (цитохром аа₃) - наиболее изучен­ный из трех комплексов. Он состоит не менее чем из восьми различных полипептидных цепей и выделен как димерс молекулярной массой 300000; каждый мономер содержит два цитохрома и два атома меди.этот комплекс принимает электроны от цитохрома с и передает их на кислород.

Цитохромы, железо-серные центры и атомы меди способны переносит одновременно только один электрон. Между тем, каждая молекула НАДН отдает два электрона и каждая молекула О₂ должна принять 4 электрона при образовании молекулы воды. В электронтранспортной цепи имеется несколько электронсобирающих и электронраспределяющих участков, где согласовывается разница в числе электронов. Так, например, цитохромоксидазный комплекс принимает от молекул цитохрома с по отдельности 4 электрона и в конечном итоге передает их на одну связанную молекулу О₂, что ведет к образованию двух молекул воды. На промежуточных ступенях этого процесса два электрона, прежде чем перейти к участку, связывающему кислород, поступают в гем цитохрома а, и связанный с белком атом меди, Cu_a. В свою очередь участок связывания кислорода содержит еще один атом меди и гем цитохрома а₃. Однако механизм образования двух молекул воды в результате взаимодействия связанной молекулы О₂ с четырьмя протонами в точности не известен.

В большинстве клеток с цитохромоксидазой взаимодействует около 90% всего поглощаемого кислорода. Токсичность таких ядов, как цианид и азид, связаны с их способностью прочно присоединяться к цитохромоксидазному комплексу и блокировать тем самым весь транспорт электронов.

Два компонента, переносящие электроны между тремя главными ферментными комплексами дыхательной цепи, - убихинон и цитохром с – быстро перемещаются путем диффузии в плоскости мембран.

Столкновения между этими подвижными переносчиками и ферментными комплексами вполне позволяют объяснить наблюдаемую ско­рость переноса электронов (каждый комплекс отдает и принимает один электрон каждые 5-10 миллисекунд). Поэтому нет необходимости предполагать структурную упорядоченность цепи белков-переносчиков в липидном бислое; в самом деле, ферментные комплексы, видимо существуют в мембране как независимые компоненты и упорядоченный перенос электронов обеспечивается только специфичностью функциональных взаимодействий между компонентами цепи.

В пользу этого говорит и тот факт, что различные компоненты дыхательной цепи присутствуют в совершенно разных количествах. Например, в митохондриях сердца на каждую молекулу НАДН-дегидрогеназного комплекса приходятся З молекулы _| комплекса b-c₁ комплекса, 7 молекул цитохромоксидазного комплекса, 9 молекул цитохрома с и 50 молекул убихинона; весьма различные соотношения этих белков обнаружены и в некоторых других клетках.

Значительный перепад окислительно-восстановительного потенциала на каждом из трех комплексов дыхательной цепи доставляет энергию, необходимую для перекачивания протонов.

Такую пару, как Н₂О и ½О₂ (или НАДH и НАД⁺), называют сопряженной окислительно-восстановительной парой, так как один из ее членов превращается в другой, если добавить один или несколько электронов и один или несколько протонов (последних всегда доста­точно в любом водном растворе). Так, например, ½О₂ + 2е + 2Н⁺  Н₂О

Хорошо известно, что смесь соединений, образующих сопряженную кислотно-щелочную пару, в соотношении 50:50 действует как буфер, поддерживающий определенное «давление протонов» (рН), величина которого определяется константой диссоциации кислоты. Точно таким же образом смесь компонентов пары в соотношении 50:50 поддерживает определенное «давление электронов», или окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) Е, служащий мерой сродства молекулы-переносчика к электронам.

Помещая электроды в раствор с соответствующими окислительно-восстановительными парами, можно измерить редокс-потенциал каж-дого переносчика электронов, участвующего в биологических окислительно-восстановительных реакциях. Пары соединений с наиболее отрицательными значениями редокс-потенциала обладают наименьшим сродством к электронам, т.е. coдepжaт перенocчики с наименьшей тенденцией принимать электроны и наибольшей тенденцией их отдавать. Например, смесь НАДH и НАД⁺ (50:50) имеет редокс-потенциал -320 мВ, что указывает на сильно выраженную способность НАДH отдавать электроны, тогда как редокс-потенциал смеси равных ко­личеств Н₂О и ½О₂ составляет +820 мВ, что означает сильную тенденцию 0₂ к принятию электронов.

Резкий перепад имеет место в пределах каждого из трех главных дыхательных комлексов. Разность потенциалов между любыми_двумя переносчиками электронов прямо пропорциональна энергии, высвобождаемой при переходе электрона от одного переносчика к другому. Каждый комплекс действует как энергопреобразующее устройство, направляя эту свободную энергию на перемещение протонов через мембрану, что приводит к созданию электрохимического протонного градиента по мере прохождения электронов по цепи.

Для работы энергопреобразующего механизма, лежащего в основе окислительного фосфорилирования, нужно, чтобы каждый ферментный комплекс дыхательной цепи был ориентирован во внутренней митохондриальной мембране определенным образом – так, чтобы все протоны перемещались в одном направлении, т. е. из матрикса наружу. Такая векторная организация мембранных белков была продемонстрирована с помощью специальных зондов, не проходящих сквозь мембрану, которыми метили комплекс только с какой-нибудь одной стороны мембраны. Специфическая ориентация в бислоe свойственна всем мембранным белкам и очень важна для их функции.

Механизмы перекачивания протонов компонентами дыхательной цепи.

В процессе окислительного фосфорилирования при окислении одной молекулы НАДН (т.е. при прохождений двух электронов через все три ферментных комплекса) образуется не более трех молекул АТФ. Если предположить, что обратное прохождение трех протонов через АТФ-синтетазу обеспечивает синтез одной молекулы АТФ, можно будет заключить, что в среднем перенос одного электрона каждым комплексом сопровождается перемещением полутора протонов (иными словами, при транспорте одного электрона некоторые комплексы перекачивают один протон, а другие - два протона). Вероятно, у разных компонентов дыхательной цепи существуют разные механизмы сопряжения транспорта электронов с перемещением протонов. Аллостерические изменения конформации белковой молекулы, связанные с транспортом электронов, могут в принципе сопровождаться «перекачиванием» протонов, подобно тому как перемещаются протоны при обращении действия АТФ-синтетазы. При переносе каждого электрона хинон захватывает из водной среды протон, который затем отдает при высвобождении электрона. Поскольку убихинон свободно передвигается в липидном бислое, он может принимать электроны вблизи внутренней поверхности мембраны и передавать их на комплекс b-с₁ около ее наружной поверхности, перемещая при этом через бислой по одному протону на каждый перенесенный электрон. С помощью более сложных моделей можно объяснить и перемещение комплексом b-c₁ двух протонов на каждый электрон, предположив, что убихинон повторно проходит через комплекс b-c₁ в определенном направлении.

В отличие от этого молекулы, передающие электроны цитохромоксидазному комплексу, по-видимому, не переносят протонов, и в этом случае транспорт электронов, вероятно, связан с определенным аллостерическим изменением конформации белковых молекул, в результате которого какая-то часть белкового комплекса сама переносит протоны.

Действие разобщителей.

С 40-х годов известен ряд липофильных слабых кислот, способных действовать как разобщающие агенты, т.е. нарушать сопряжение транспорта электронов с синтезом АТФ. При добавлении к клеткам этих низкомолекулярных органических соединений митохондрии прекраща­ют синтез АТФ, продолжая при этом поглощать кислород. В присутствии разобщающего агента, скорость транспорта электронов остается высокой, но протонный градиент не создается. Это простое объяснение этого эффекта: разобщающие агенты (например, динитрофенол, тироксин) действуют как переносчики Н⁺ (Н⁺-ионофоры) и открывают дополнительный путь - уже не через АТФ-синтетазу – для потока Н⁺ через внутреннюю митохондриальную мембрану.13, 2000

Дыхательный контроль.

Когда к клеткам добавляют разобщающий агент, например динитрофенол, поглощение кислорода митохондриями значительно возрастает, так как скорость переноса электронов увеличивается. Такое ускорение связано с существованием дыхательного контроля. Полагают, что этот контроль основан на прямом инги6ирующем влиянии электрохимического протонного градиента на транспорт электронов. Когда в присутствии разобщителя электрохимический градиент исчезает, не контролируемый более транспорт электронов достигает максимальной скорости. Возрастание градиента притормаживает дыхательную цепь, и транспорт электронов замедляется. Более того, если в эксперименте искусственно создать на внутренней мембране необычно высокий электрохимический градиент, то нормальный транспорт электронов прекратится совсем, а на некоторых участках дыхательной цепи можно будет обнаружить обратный поток электронов. Это позволяет пред­полагать, что дыхательный контроль отражает простой баланс между изменением свободной энергии при перемещении протонов, сопряжен­ного с транспортом электронов, и изменением свободной энергии при самом транспорте электронов.Величина электрохимического градиента влияет как на скорость, так и на направление переноса электронов, так же как и на направление действия АТФ-синтетазы.