Раньше думали, что энергию для синтеза АТФ в дыхательной цепи обеспечивает такой же механизм, как и при субстратном фосфорилировании: предполагалось, что энергия окисления используется для образования высокоэнергетической связи между фосфатной группой и каким-то промежуточным соединением и, что превращение AДФ в АТФ осуществляется за счет энергии, выделяемой при разрыве этой связи. Однако, несмотря на интенсивные поиски, предполагаемый интермедиат не был обнаружен.

Согласно хемиосмотической гипотезе, вместо богатых энергией промежуточных продуктов существует прямая связь между процессами химическими («хеми...») и транспортными (осмотическими, от греческого osmos - толчок, давление) - хемиосмотическое сопряжение.

Хемиосмотическая гипотеза, предложенная в начале 60-х годов, включала четыре независимых постулата, касавшиеся функции митохондрий:

1. Митохондриальная дыхательная цепь, находящаяся во внутренней мембране, способна перемещать протоны; при прохождении электронов по дыхательной цепи происходит «откачивание» Н⁺ из матрикса.

2. Митохондриальный АТФ-синтетазный комплекс тоже перемещает протоны через внутреннюю мембрану. Поскольку этот процесс обратим, фермент может не только использовать энергию гидролиза АТФ для переноса Н ⁺ через мембрану, но при достаточно большом протонном градиенте протоны начи­нают «течь» через АТФ-синтетазу в обратном направлении, что сопровож­дается синтезом АТФ.

3. Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для Н ⁺, ОН^- и вообще всех анионов и катионов.

4. Внутренняя митохондриальная мембрана содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт необходимых метаболитов и неорганических ионов.

При прохождении высокоэнергетических электронов, доставляемых НАДН и ФАДH₂, по дыхательной цепи внутренней митохондриальной мембраны от одного переносчика к следующему высвобождается энергия, которая используется для перекачивания протонов (Н⁺) через внутреннюю мембрану из матрикса в межмембранное пространство. (см.рисунок 2)

Рисунок 2. Перенос протонов при участии АТФ-синтазной системы (модель Митчелла).[10,1993]

В результате на внутренней мембране создается электрохимический протонный градиент; энергию о6ратного тока протонов «вниз» по этому градиенту используется связанный с мембраной фермент АТФ-синтетаза, катализирующий образование ATФ из АДФ и Ф_н, т.е. завершающий этап окислительного фосфорилирования.

Редокс-цепь окислительного фосфорилирования.

Электроны переносятся с НАДН на кислород с помощью трех больших ферментных комплексов дыхательной цепи. Хотя механизмы извлечения энергии в дыхательной цепи и в других катаболических реакциях различны, в их основе лежат общие принципы. Реакция Н₂ + 1/2 О₂  Н₂О разбита на много небольших «шагов», так что высвобождаемая энергия может переходить в связан­ные формы, а не рассеивается в виде тепла. Как и в случае образования АТФ и НАДH при гликолизе или в цикле лимонной кислоты, это связано с использованием непрямого пути. Но уникальность дыхательной цепи заключается в том, что здесь прежде всего атомы водорода расщепляются на электроны и протоны. Электроны передаются через серию переносчиков, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Когда электроны достигают конца этой электронтранспортной цепи, протоны оказываются там же для нейтрализации отрицательного заряда, возникающего при переходе электронов на молекулу кислорода.

Проследим процесс окисления, начиная с образования НАДH - главного акцептора реактивных электронов, извлекаемых при окислении молекул питательных веществ. Каждый атом водорода состоит из одного электрона и одного протона. Каждая молекула НАДH несет гидрид-ион (водо­родный атом + добавочный электрон, Н:^-), а не просто атом водорода. Однако из-за присутствия в окружающем водном растворе свободных протонов перенос гидрид-иона в составе НАДH эквива­лентен переносу двух атомов водорода или молекулы водорода (Н:^- + Н⁺  Н₂).

Перенос электронов по дыхательной цепи начинается с отнятия гидрид-иона (Н:^-) от НАДH; при этом регенерируется НАД⁺ , a гидрид-ион превращается в протон и два электрона (Н:^-  Н⁺ + 2е^-). Эти электроны переходят на первый из более чем 15 различных переносчиков электронов в дыхательной цепи. В этот момент электроны обладают очень большой энергией, запас которой постепенно уменьшается по мере прохождения их по цепи. Чаще всего электроны переходят от одного атома металла к другому, причем каждый из этих атомов прочно связан с белковой молекулой, которая влияет на его сродство к электрону. Важно отметить, что все белки – переносчики электронов – группируются в три больших комплекса дыхательных ферментов, каждый из которых содержит трансмембранные белки, прочно закрепляющие комплекс во внутренней мембране митохондрии. Каждый последующий комплекс обладает большим сродством к электронам, чем предыдущий. Электроны последовательно переходят с одного комплекса на другой, пока наконец не перейдут на кислород, имеющий наибольшее сродство к электрону.

Энергия, высвобождаемая в процессе переноса электронов по дыхательной цепи, запасается в форме электрохимического протонного градиента на внутренней мембране митохондрий.

Окислительное фосфорилирование возможно благодаря тесной ассоциации переносчиков электронов с белковыми молекулами. Белки направляют электроны по дыхательной цепи так, что они последо­вательно переходят от одного ферментного комплекса к другому, не «перескакивая» через промежуточные звенья. Особенно важно то, что перенос электронов сопряжен с аллостерическими изменениями определенных белков молекул, в pезультате чего энергетически выгодный поток электронов вызывает перекачивание протонов (Н⁺) через внутреннюю мем6рану из матрикса в межмембранное пространство и далее за пределы митохондрии. Передвижение протонов приводит к двум важным следствиям: 1) между двумя сторонами внутренней мембраны создается градиент рН - в матриксе рН выше, чём в цитозоле, где значение рН обычно близко к 7,0 (так как малые молекулы свободно проходят через наружную мембрану митохондрии, рН в межмембранном пространстве будет таким же как в цитозоле); 2) на внутренней мембране создается градиент напряжения (мембранный потенциал), причем внутренняя сторона мембраны заряжается отрицательно, а наружная - положительно. Градиент рН (рН) заставляет ионы Н⁺ переходить обратно в матрикс, а ионы ОН^- из матрикса, что усиливает эффект мембранного потенциала, под действием которого любой положительный заряд притягивается в матрикс, а любой отрицательный выталкивается из него. Совместное действие этих двух сил приводит к возникновению электрохимического протонного градиента. Электорохимический протонный градиент создает протонодвижущую силу, измеряемую в милливольтах (мВ).

Энергия электрохимического протонного градиента используется для синтеза АТФ и транспорта метаболитов и неорганических ионов в матрикс.

Внутренняя мембрана митохондрий отличается необычно высоким содержанием белка - в ней по весу примерно 70% белка и 30%фосфолипидов. Многие из этих белков входят в состав электронтранспортной цепи, поддерживающей протонный градиент на мембране. Другой важный компонент - фермент АТФ-синтетаза, катализирующий синтез АТФ. Это большой белковый комплекс, через который протоны перетекают обратно в матрикс по электрохимическому градиенту. Подобно турбине, АТФ-синтетаза преобразует одну форму энергии в другую, синтезируя АТФ из AДФ и Ф_н в митохондриальном матриксе в ходе реакции, сопряжённой с током протонов в матрикс (см. рисунок 3).

Рисунок 3. Общий механизм окислительного фосфорилирования.[1,1994]

Но синтез АТФ - это не единственный процесс, идущий за счет энергии электрохимического градиента. В матриксе, где находятся ферменты, участвующие в цикле лимонной кислоты и других мета­болических реакциях, необходимо поддерживать высокие концентрации различных субстратов; в частности, для АТФ-синтетазы требуются AДФ и фосфат. Поэтому через внутреннюю мембрану должны транспортироваться разнообразные несущие заряд субстраты. Это достигается с помощью различных белков-переносчиков, встроенных в мембрану, многие из которых активно перекачивают определенные молекулы против их электрохимических градиентов, т.е. осуществляют процесс, требующий затраты энергии. Для большей части метаболитов источником этой энергии, служит сопряжение с перемещением каких-то других молекул «вниз» по их электрохимическому градиенту. Например, в транспорте АДФ участвует система антипорта АДФ-АТФ: при переходе каждой молекулы AДФ в матрикс из него выходит по своему электрохимическому градиенту одна молекула АТФ. В то же время система симпорта сопрягает переход фосфата внутрь митохондрии с направленным туда же потоком Н⁺: протоны входят в матрикс по своему градиенту и при этом “тащат” за собой фосфат. Подобны образом переносится в матрикс и пируват. Энергия электрохимического протонного градиента используется также для переноса в матрикс ионов Са²⁺ , которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции активности некоторых митохондриальных ферментов.

Чем больше энергии электрохимического градиента затрачивается на перенос молекул и ионов в митохондрию, тем меньше остается для синтеза АТФ. Например, если изолированные митохондрии поместить в среду с высоким содержанием Са^{2 +} , то они полностью прекратят синтез АТФ; вся энергия градиента будет расходоваться на транспорт Ca²⁺ в матьрикс. В некоторых специализированных клетках электрохимический протонный градиент «шунтируется» таким образом, что митохондрии вместо синтеза АТФ образуют тепло. Очевидно, клетки способны регулировать использование энергии электрохимического протонного градиента и направлять ее на те процессы, которые наиболее важны в данный момент.

Быстрое превращение АДФ в АТФ в митохондриях позволяет поддерживать высокое отношение концентраций ATФ/AДФ в клетках. С помощью особого белка, встроенного во внутреннюю мембрану, AДФ транспортируется в матрикс в обмен на АТФ по принципу антипорта. В результате молекулы AДФ, высвобождаемые при гидролизе АТФ в цитозоле, быстро поступают в митохондрию для «перезарядки», в то время как молекулы АТФ, образующиеся в матриксе в процессе окислительного фосфорилирования, тоже быстро выходят в цитозоль, где они нужны. В организме человека молекулы АТФ за сутки, что позволяет поддерживать в клетке концентрацию АТФ, более чем в 10 раз превышающую концентрацию АДФ.

В процессе окислительного фосфорилирования каждая пара электронов НАДH обеспечивает энергией образование примерно трех молекул АТФ. Пара электронов ФАДH₂, обладающая меньшей энергией, дает энергию для синтеза только двух молекул АТФ. В среднем каждая молекула ацетил-СоА поступающая в цикл лимонной кислоты, дает около 12 молекул АТФ. Это означает, что при окислении одной молекулы глюкозы образуются 24 молекулы АТФ, а при окислении одной молекулы пальмитата - жирной кислоты с 16 углеродными атомами - 96 молекул АТФ. Если учесть также экзотермические реакции, предшест­вующие образованию ацетил-СоА, окажется, что полное окисление одной молекулы глюкозы дает около 36 молекул АТФ, тогда как при полном окислении пальмитата образуется примерно 129 молекул АТФ. Это максимальные величины, так как фактически количество синтезируемого в митохондриях АТФ зависит от того_, какая доля энергии протонного градиента идет на синтез АТФ, а не на другие процессы. Если сравнитъ изменение свободной энергии при сгорании жиров и углеводов прямо до СО₂ и Н₂О с общим количеством энергии, запасаемой в фосфатных связях АТРФ в процессах биологического окисления, окажется, что эффективность преобразования, энергии окисления в энергию АТФ часто превышает 50%. Поскольку вся неиспользованная энергия высвобождается в виде тепла, крупные организмы нуждались бы в более эффективных способах отвода тепла в окружающую среду.

Огромное количество свободной энергии, высвобождаемое при окислении, может эффективно использоваться только мелкими порциями. В сложном процессе окисления участвует много промежуточных продуктов, каждый из которых лишь незна­чительно отличается от предыдущего. Благодаря этому высвобождаемая энергия дробится на меньшие количества, которые можно эффективно преобразовывать с помощью сопряженных реакций в высо­коэнергетические связи молекул АТФ и НАДH .

В 1960 г. было впервые показано, что различные мембранные белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, могут быть вы­делены без потери активности. От поверхности субмитохондриальных частиц удалось отделить и перевести в растворимую форму усеивающие их крошечные белковые структуры. Хотя субмитохондриальные частицы без этих сферических структур продолжали окислять НАДH в присутствии кислорода, синтеза АТФ при э^том не происходило. С другой стороны, выделенные структуры действовали как АТФазы, гидролизуя АТФ до АДФ и Ф_н. Когда сферические структуры (названные F₁-АТФазами) добавляли к лишенным их субмитохондриальным частицам, реконструированные частицы вновь синтезировали АТФ из AДФ и Ф_н.