9490 (Биологическая роль, структура и выделение митохондрий из печени крыс.), страница 2

С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить препараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты. Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой струйкой в разделяющий буфер, который движется в электрическом поле; мембраны, несущие разный электрический заряд перемещаются в разделяющей ячейке со скоростью, определяемой их зарядом, при этом достигается 100 %-ное разрешение. Это мягкий способ выделения мембран с высоким препаративным выходом. Методику электрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения лизосом и митохондрий из печени крысы.

Таблица 1. Ферменты - маркеры митохондрий

В таблице 1 приведены ферментные маркеры, к которым относятся сравнительно стабильные ферменты, активность которых достаточно высока и ее удобно измерять. Обычно эти измерения проводят как можно быстрее после выделения; образец при этом хранят при 40С и не замораживают. Отмечено, что такой фермент, как цитохром с - редуктаза может оказаться лабильным и терять активность в замороженных препаратах мембран из печени. Для правильной оценки распределения фермента-маркера весьма существенным является пространственное расположение субстрат-связывающего сайта.

Методики

Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий.

Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартными методами. Субфракционирование их для получения внутренних и наружных мембран и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаивания препарата и / или обработки ультразвуком стандартного осадка митохондрий, суспендированных в среде, содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР (10 мг мембранного белка на 1 мл). При этом происходит разрушение митохондрий, а после центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наружные мембраны концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраны и компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрацией сахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумя предыдущими, в полосе 1,12-1,20М.

Маркерами внутренних митохондриальных мембран служат ферменты - переносчики электронов. Наружная митохондриальная мембрана, которая при фрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии с везикулами из плазматической мембраны содержит моноаминооксидазу. Описан также метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени крыс.

Метод противоточного распределения митохондрий.

Препараты митохондрий, выделенные из печени крысы, были исследованы Эрикссоном с помощью метода противоточного распределения. Митохондрий, входящие в состав каждого из этих препаратов, можно разделить на две основные популяции. Однако элетронно-микроскопическое исследование не позволило обнаружить никаких различий в структуре этих частиц.

Рабочая методика выделения митохондрий из печени крыс.

• Среда выделения: 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 0,001 М ЭДТА, рН 7,4

• Сахароза - 0,25 М раствор

• НС1 - 1 н и 0,1 н растворы

• КОН - 1 н и 0,1 н растворы

Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде.

Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После 2х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно, жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 секунд. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в 2 центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 минут при 0-2 ОС, при 600 д для удаления обломков клеток и ядерной фракции.

Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, остатки объединяют и вновь гомогенизируют 20 секунд в 20 мл среды выделения. Гомогенат центрифугируют при 600 д 10 минут, супернатант объединяют с полученным ранее.

Для осаждения митохондрии, объединенный супернатант центрифугируют в двух стаканах при 14000 g в течение 10 минут. Остатки объединяют в одном стакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшом объеме среды выделения (около 0,5 мл). .Маленькими порциями, при осторожном встряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии (14000 g, 10 минут). Осадок суспендируют в 0,25 М сахарозе, не содержащей ЭДТА, и вновь центрифугируют (14000 g, 10 минут). Супернатант сливают, на полученный осадок митохондрии осторожно наслаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарозы. Легким встряхиванием смывают верхний рыхлый слой осадка. Процедуру повторяют еще дважды и полученный плотный осадок митохондрии тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы. Густую суспензию митохондрии переносят в пробирку и хранят на льду.

Заключение

В данной работе предложены различные методики выделения митохондрии из печени крыс, но использоваться будет метод с применением ультрацентрифугирования, как наиболее приемлемый и удовлетворяющий критериям простоты работы и необходимой степени чистоты продукта.

В дальнейшем планируется фотометрическое изучение влияния этидиум бромида на активность цитохрома с из митохондрии печени крыс. Данная работа представляет практический интерес, так как цитохром с является индуктором апоптоза - программированной гибели клеток. Механизмы этого процесса в настоящее время представляют большой интерес (для лечения онкологических заболеваний).

Список литературы

1. Альбертсон Пер-Оке "Разделение клеточных частиц и макромолекул", Москва, 1974

2. Боуэн Т. "Введение в ультрацентрифугирование", Москва, 1973

3. Под ред. Гилярова М.С. "Биология. Большой энциклопедический словарь", Москва, 1998

4. Ленинджер А. "Митохонрия" Москва "Мир", 1966

5. Решетников В.Н. и др. "Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров" т.2, Минск, 1977

6. Эванз У. Г. "Биологические мембраны. Методы", Москва, 1990

14