Diplom (Біохімія трансгенної картоплі в умовах України), страница 3

Взимку переважають північно-східний та північно-західний вітри. Напрямок їх часто змінюється, що призводить до різних змін температури. За останні роки спостерігаються суховійні південно-східні вітри, які сильно висушують грунт і знижують врожай основних сільськогосподарських культур.

Рельєф УНВК рівнинний, але західна частина дещо полога і засівається багаторічними травами.

Грунти, які представлені на дослідному полі, -це типові чорноземи, важкосуглинисті, середньогумусні на льосовидному суглинку. Грунт характеризується високим вмістом крупнопилови часток (0,01-0,05 мм), частка яких сягає 55% і більше. Вміст часток, які належать до фракції розміром 0,001 мм і менше сягає 25-30%, що обумовлює високу ємність поглинання, яка досягає 28-30 мг/екв на 100 г грунту. Реакція грунту практично нейтральна. Значення рН коливається в межах 6,5-7,5/6,5-7,6 у верхніх горизонтах і 7,3-7,5 у нижніх (карбонатних).

Розорювана частина грунту приблизно до 30 см., яка містить у собі необхідні елементи живлення (N, P, K) : азоту нітратного 2,2-3,; азота амонійного 11,2-10,6; фосфора 157, калія 70 мг на 100 г грунту, відсоток гумусу 4,0%.

УНВК заснований в 1987 р. для проведення науково-дослідної роботи та для демонстрації різних технологій вирощування сільськогосподарських культур. До складу УНВК входять комплекс по оздоровленню насінневої картоплі методами меристеми, обласне об’єднання “Сортнасіняовоч” і науково-дослідне об’єднання “Еліта” з лабораторією картоплі і дослідним господарством. До складу господарства також входять дослідні поля в с.Постольне, Гамаліївка та Косівщина, де вирощуються озима пшениця, овес, гречка, картопля, ячмінь, овес, гречка, горох, багаторічні трави, капуста, морква, столові буряки, цибуля. Урожайність деяких культур в 2000 році: озима пшениця 35 ц/га; овес 41 ц/га; гречка 20 ц/га; картопля 150 ц/га; соняшник 15 ц/га; яра пшениця 13 ц/га; горох 13 ц/га; буряки цукрові 460 ц/га; кукурудза на зерно – 42 ц/га.

Дослідні поля УНВК займають 43 га сільськогосподарських угідь. Сівозміна займає майже всі 43 га. Схема сівозміни така:

1. Овес 10 га.

2. Озима пшениця 5 га.

3. Картопля (насіння )0,7.

4. Ячмінь .

5. Гречка 4,6 га.

6. Цукровий буряк 10 га.

Із сівозміни виділена ділянка 2,5 га, розміщена на схилі, яка засівається багаторічними травами для тварин віварія.

Крім того в межах УНВК вирощували в 2000 р.такі культури:

1. Багаторічні трави 2,4 га

2. Молодий сад 3 га

3. Томати 0,2 га

4. Цибуля 0,25 га

5. Буряки столові 0,07 га

6. Морква 0,07 га

7. Кріп 0,01 га

8. Петрушка 0,01 га

9. Капуста 0,75 га

10. Огірки 0,05 га.

На дослідних ділянках проводять експериментальні роботи кафедри селекції (0,7 га) і рослинництва (0,3 га).

Для роботи на дослідних полях УНВК закріплений підрозділ і повний комплекс тракторів та сільськогосподарського обладнання. Для проведення дослідів виділено ділянки площею в 0,1 га. В склад підрозділу входять: завідуючий дослідним полем і два інженери. Для зберігання і ремонту техніки за дослідним полем закріплений спеціальний бокс, а для зберігання зернової продукції - ангар. Техніка УНВК представлена тракторами Т-150, Т-70, Т-150К, МТЗ-82, Т-25, Т-16.

3. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

В експериментi використовувались бульби та квітки картоплi сортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic (зразки люб’язно надані проф.А.А.Підгаєцьким, Інститут картоплярства УААН, смт.Немішаєве, Київська обл.). Зразки бульб: висічки сумарною масою 500 мг вiдбирали з 3 місць бульб картоплi (верхівка, середина та пуповинна частина). Маса зразків квіток дорівнювала 200-300 мг. Висічки бульб та зразки квіток мілко нарізували, перемішували і ретельно розтирали на холоді (0С) в порцеляновій чашці. В розтерту масу додавали 1 мл 5% оцтової кислоти. Ретельно перемішували одержану масу і залишали її стояти протягом 2-х годин. Після цього фільтрували масу, відбирали рідку фазу і підсушували її в струмені теплого повітря. Одержанi рідкофазні зразки центрифугували (300 g), вiдбирали алiквоти рідкої фази об'ємом 20 мкл і наносили на металеву (Au) поверхню зразконесучого диска приладу "МСБХ" (біохімічний мас-спектрометр «МСБX» виробництва ВAТ SELMI, Суми, Україна) з наступною реєстрацією мас-спектра (кiлькiсть вiдлiкiв 40000-200000); прискорююча напруга + 10 кВ)(контроль).

Аналiз одержаного мас-спектра проводили за допомогою сервiсної програми статистичної i математичної обробки спектрiв "МСБХ4" (НДI радіаційної технiки та автоматизації, Москва). Мас-спектри мiстили пiки квазимолекулярних iонiв (КМI) типу [М+Н]⁺, де М - молекулярна маса аналізованої речовини (глiкоалкалоїду) в атомних одиницях маси (Да), Н – протон, зокрема, -чаконіну з молеку­­­лярною масою 851,0 Да вiдповiдає пiк КМI з молекулярною масою 852,0; -соланiну - з масою 868,0.

Виходячи з спiввiдношень iнтенсивностi КМI глiкоалкалоїдiв проводили визначення кiлькостi останнiх в зразках. Для кожного зразка екстракту глiкоалкалоiдiв квіток рослин картоплi проводили по три вимiрювання з наступним усередненням результатiв за допомогою сервiсної програми.

Глікоалкалоїди для отримання калібрувальної кривої отримували з етиольованих ротків картоплі шляхом багаторазової обробки: екстрагування 2% оцтовою кислотою, осадження 25% водним рочином аміаку з підігріваням на водяній бані до випадання осаду, центрифугування, відділення осаду від надосадкової рідини, розчинення осаду в 2% оцтовій кислоті і т.д. до тих пір, поки не будуть отримані чисті кристали глікоалкалоїдів.

Визначення рівня стiйкостi сортiв картоплi до фiтопатогенiв в модельних системах in vitro визначали за методикою Кожушко Н.С., Чіванова В.Д. [ ]. Модельна система для визначення кінетичних параметрів деструкції глікоалкалоїдів складалась з 500 мг тканини бульби картоплі гомогенізованої в 5 мл середовища інкубації - 0,17% розчинi оцтової кислоти (pH 5,4-5,5), доповненої змiшаною польовою культурою грибiв Phytophthora infestans та Fusarium oxysporum spp.[ ]. За контроль правила гомогенізована тканина бульб в стерильному середовищі інкубації без домішок. Iнкубували модельнi системи при 37^оC в термостаті, вiдбираючи зразки (100 мкл) на початку інкубації і в подальшому через 1, 2, 3, 4, 5 та 6 дiб. Одержанi зразки центрифугували, вiдбирали алiквоти рідкої фази об'ємом 20 мкл, які аналізували як вказано вище.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Мас-спектрометрія PDMS досить давно з успіхом використовується з метою аналіза кількісного та якісного складу глікоалкалоїдів рослин картоплі різних сортів [ ].

Так, в якості прикладу наводимо типовий мас-спектр свіжого екстракту з гомогенату бульб картоплі сорту Невська (рис.2). Порівняльна інтенсивність піків КМІ іонів a-соланіну та a-чаконіну в цьому мас-спектрі відповідає реальному кількісному співвідношенню цих сполук в тканинах бульб картоплі даного сорту – відомо, що для всіх культурних видів картоплі відношення a-чаконін : a-соланін дорівнює 2(3) : 1. Останнє вірно у тому разі, якщо в тканинах рослини картоплі даного сорту гідролітичні ферменти є помірно активними, тобто не піддають швидкій деструкції глікоалкалоїди шляхом відщеплення кінцевих залишків моносахаридів.

Крім інтенсивних піків КМІ, що відповідають a-соланіну та a-чаконіну в мас-спектрі присутні також «мінорні» пікі КМІ, які належать b-чаконіну (молекулярна маса 706 Да) та аглікону глікоалкалоїдів – соланідіну (молекулярна маса 398 Да)(рис.3). Зазначені сполуки виникають внаслідок перебігу процесів ферментативноі\хімічної деструкції інтактних молекул глікоалкалоїдів, які супроводжуються вiдщепленням вiд молекули a-чаконiну

L-Rha

Solanidine - D-Gal (Mолекулярна маса 851 Да)

L-Rha

залишку рамнози (L-Rha) з утворенням b-чаконіну:

Solanidine - D-Gal - L-Rha (Mолекулярна маса 705 Да).

Подальша гідролітична деструкція b-чаконіну призводить до появи в середовищі інкубації вільного соланідину з молекулярною масою 398 Да. Незначна інтенсивність піків КМІ, що відповідають продуктам деструкції свідчить про те, що внутрішньотканинні ферменти і в першу чергу рамнозидаза, яка відщеплює кінцевий залишок рамнози від молекули глікоалкалоїду, знаходяться в інтактних тканинах рослин картоплі в неактивному стані. Як відомо, лише нативні молекули глікоалкалоїдів, проявляють притаманні їм потужні фунгіцидні властивості щодо фітопатогенів [ ]. Відповідно підвищення активності гідролітичних ферментів, індуковане механічними або хімічними чинниками, призводить залежно від глибини деструкційного процесу до часткової чи повної втрати глікоалкалоїдами фунгіцидної активності. Одним з таких чинників є фітопатогени: добре відомо, що бiохiмiчнi аспекти взаємодii фiтопатогенних грибiв з рослинними клiтинами передбачають як ключову компоненту детоксифiкуючий вплив спецiалiзованих ферментних систем грибiв на "захиснi" бiомолекули уражених рослин, зокрема глікоалкалоїди. Так, Phytophthora infestans dB та Fusarium oxysporum Schl. пiддають гiдролiтичнiй деструкцiї глiкоалкалоїди картоплi в процесi iнвазiї, спричинюючи таким чином втрату ними фунгiцидних властивостей [ ]. Дійсно, після 6-ти діб інкубації екстракта гомогенату з бульб картоплі сорту Невська в присутності фітопатогенів мас-спектр значно змінюється, а саме: інтенсивність піків КМІ a-соланіна і a-чаконіна різко знижується з паралельним зростанням інтенсивності відповідних піків КМІ, що належать b-чаконіну і соланідину (рис.3).

Якщо негативний вплив фітопатогенів «накладається» на притаманну конкретному сорту картоплі підвищену активність рамнозидази та споріднених ферментів, то сумація зазначених чинників створює оптимальні умови для повної нейтралізації фунгіцидної активності глікоалкалоїдів за короткий проміжок часу.

Рис.2. Мас-спектр екстракту з гомогенату тканин бульб картоплі сорту

Невська (контроль). Тут і на подальших рисунках інтенсивність

піків КМІ надана в умовних одиницях (ум.од.) – кількостях

відліків (стартів).

Рис. 3. Мас-спектр екстракту з гомогената тканин бульб картоплі сорту

Невська після 6-ти добової інкубації з фітопатогенами (Phytophthora

infestans dB і Fusarium spp. (дослід).

Навпаки, сорти картоплі, рослинам яких притаманна низька активність гідролітичних ферментів, протистоять фітопатогенам на протягом довшого проміжку часу, і є, таким чином, порівняно стійкими щодо фітопатогенів. Зважаючи на те, що ступінь активності ферментних систем є для сортів і гібридів генетично обумовленою ознакою, ми висловили припущення про наявність безпосереднього зв’язку між швидкістю деструкції молекул глікоалкалоїдів в тканинах рослини, обумовленою сумарною активністю ферментних систем рослини і фітопатогенів і ступенем стійкості окремих сортів картоплі до цих фітопатогенів. Нами досліджені кінетичні параметри ферментативної гідролітичної деструкції глікоалкалоїдів тканин бульб картоплі сортів Свiтанок київський, Невська, Молодiжна, та трансгенної картоплі NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic які значно різняться між собою за ступенем стійкості до фітопатогенів. Зокрема, Світанок київський порівняно стійкий до Phytophthora infestans dB та багатьох інших фітопатогенів; Невська, - середньостійка, а Молодіжна є сортом, малостійким до фітопатогенів. Щодо рослин трансгенної картоплі, то в літературі є свідчення на користь зниженого ступеня стійкості сортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic по відношенню до збудників хвороб.

Попередні експерименти з встановлення кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів, притаманних рослинам трансгенних сортів картоплі, показали, що принципові відмінності останніх за зазначеними параметрами від класичних сортів відсутні (рис.4 і 5).

Як видно з рис.4 і 5, в тканинах квіток рослин картоплі сорту NewLeaf 6 Atlantic (рис.4) та NewLeaf 6 Russet Burbank (рис.5) присутні глікоалкалоїди α-соланін (868 а.о.м.) та α-чаконін (852 а.о.м.).

Рис.4. PDMS мас-спектр екстракту з квіток рослин картоплі сорту NewLeaf 6

Atlantic.

Рис.5. PDMS мас-спектр екстракту з квіток рослин картоплі сорту NewLeaf 6 Russet

Burbank.

Рис.6. PDMS мас-спектр екстракту з бульб рослин картоплі сорту NewLeaf 6 Russet