apoptoz (Апоптоз - программируемая клеточная смерть)

У многоклеточных организмов – животных, растений и грибов – генетически заложена программа гибели клеток. Формообразовательные процессы в онтогенезе, позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов у животных, гиперчувствительный ответ растений на вторжение патогена, осенний листопад – лишь несколько примеров программируемой клеточной смерти (ПКС). ПКС способствует сохранению порядка и нормального функционирования биологической системы, очищая от невостребованных, больных, закончивших свой жизненный цикл или появившихся врезультате мутаций потенциально опасных клеток.

7октября 2002 г. Нобелев­ский комитет по физиоло­гии и медицине в Каролин­ском институте Стокгольма объ­явил о присуждении премии С.Бреннеру , X.P.Xopвицу и Дж.Салстону «за открытие в об­ласти генетической регуляции развития органов и запрограм­мированной смерти клетки».

Тот факт, что онтогенез на­ходится под генетическим кон­тролем, вряд ли мог кого-то уди­вить даже в далекие уже 70-е го­ды ушедшего XX в. Такой кон­троль должен был быть, и нашел его Бреннер Двое других «нобелевцев» открыли «гены смерти».

Давно уже было очевидно, что онтогенез невозможен без ликвидации отдельных клеток, участков тканей и даже целых органов, возникающих на опре­деленных этапах индивидуаль­ного развития, чтобы затем ис­чезнуть при формировании взрослого организма. Неясно было лишь, происходит такая ликвидация посредством фаго­цитоза или каким-то другим, пока неизвестным путем.

Свои эксперементы ученые проводили на нематоде Caenorhabditis elegans.Этот объект

огромные преимущества :

a)очень мала (длиной около 1 мм )

б) прозрачна

в) живет всего пару недель. По этому было просто проследить судьбу каждой из составляющих ее 959 от оплодотворенной яйцеклетки вплоть до взрослой особи.Бреннер использовали мутаген(метилэтансульфонат) и получил мутации, останавливающие развитие отдельны этапов онтогенеза, и идентифицировал гены, ответственные за них.

Салстон обратил внимание на то, что взрослая нематода должна была бы состоять из 1090кл. а не из 959 т. е. 131 кл. погибает в ходе онтогенеза встав на путь запрограммированной смерти (апоптоза). Сал­он идентифицировал первый ген клеточного самоубийства — nuc--1, небходимый для деградации ДНК в умирающей клетке. В те же 70-е Хорвиц продол-ил исследование Бреннера он открыл гены ced-З и ced-4, необходимые для клеточного самоубийства. Впоследствии Хорвиц описол также ген ced-9, удерживающий клетку от апоптоза, пока не пришло время, и нашел соответствующие гены у высших животных и человека.

Апоптоз и некроз – два варианта клеточной смерти

Существует два различных вида клеточной смерти у животных – апоптоза и некроза.

Картина апоптоза у животных – это переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра(кариорексис и кариопикноз: кариорексис-маргинация гетерохроматина и образование кольца из отдельных глыбок ; пикноз-сжатие ядер), разрывы нити ядерной ДНК и последующий распад ядра на части, фрагментация клетки на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями. Такая же участь постигает клетку, когда в ней произошла мутация, которая может привести к опухолевому разрастанию ткани, когда она становится ненужной для организма, например, в процессе онтогенетического развития или, применительно к лимфоцитам, на заключительных этапах инфекционного процесса, когда организм уже не нуждается в дальнейшей выработке антител [5–7].

Есть и другая, патологическая, форма клеточной смерти – некроз. Такая смерть постигает клетку, когда Т-киллер своевременно не распорядился судьбой инфицированной клетки, наставив ее на путь апоптоза. Вирус или иной паразит, размножившись в клетке, разрушает ее: клетка лизируется, ее содержимое изливается наружу, в межклеточное пространство. Некоторые внутриклеточные паразиты, включая простейшее Toxoplasma gondii (возбудитель токсоплазмоза), способны к подавлению апоптоза . Новое поколение паразитов устремляется в соседние клетки, нанося все больший и больший ущерб организму. Начинается воспалительный процесс, исходом которого может быть как выздоровление, так и гибель организма. Некротическую гибель могут вызывать физические или химические повреждения, например, обморожение или ожог, органические растворители, гипоксия, отравление, гипотонический шок и др.

Наличие или отсутствие воспаления у животных используется как признак, позволяющий отличить апоптоз от некроза.

Некроз характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство (рис. 1). При апоптозе сохраняется целостность мембран, органеллы выглядят морфологически интактными, а продукты дробления клетки, апоптозные тельца (или везикулы) представляют собой отдельные фрагменты, окруженные мембраной (рис. 1).

Рис. 1. Изменение ультраструктуры клеток животных при некрозе и апоптозе. 1 – нормальная клетка, 2 – апоптотическое сморщивание клетки с образованием пузырчатых выростов, 3 – фрагментация клетки с образованием апоптотических везикул, 4 – набухание клетки при некрозе, 5 – некротическая дезинтеграция клетки

Большинство ученых сходятся в мнении, что апоптоз наступает в результате энзиматического распада хроматина в ядре клетки, при этом эндонуклеазы клетки начинают разрезать молекулу ДНК с образованием моно- и олигомеров. Нуклеазной атаке подвергаются не только эухроматиновые , но и спирализованные уплотненные гетерохроматиновые участки ядра. Для того чтобы запустить этот процесс клетка должна произвести ферменты - нуклеазы, а для этого, в свою очередь, в клетке происходит усиление процессов транскрипции (биосинтез РНК) и трансляции (биосинтез белка). Имеются данные, что ингибиторы белкового синтеза - циклогексамид и пуромицин - предотвращают энзиматический распад хроматина и могут предотвратить или отсрочить процесс апоптоза. На даный момент известно несколько путей для апоптоза.

Во-первых это путь энзиматического переваривания межнуклеосомных пространств и нарезание фрагментов размером в 200 нуклеотидов

2) во вторых это гетерохроматизация хроматина без разрезания ДНК

1 ЭТАП - Воздействие на хроматин ядра нуклеазами и (или) ферментами конденсации

2 ЭТАП - Образование фрагментов ДНК и (или) конденсация хроматина

3 ЭТАП - Резорбция хроматина (кариорексис и карилизис)

Как установлено интерфазная картина хромосом:

По этим представлениям в основе надхромосомной организации ядер у эукариот лежит общее периферическое распределение интерфазных хромосом вблизи от ядерной мембраны с прикреплением к ней участков хромосом, несущих гетерохроматиновые блоки . Места прикрепления, как правило, связаны с особой функциональной активностью тех или иных участков генома. Ассоциированная с мембраной ДНК имеет более высокий уровень повторяющихся последовательностей, чем основная часть ядерной ДНК. Как оказалось, в результате апоптоза в первую очередь страдает именно эта часть молекулы ДНК, примыкающая к ядерной мембране.

Молекулярные механизмы апоптоза

Апоптоз – многоэтапный процесс. Первый этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу.

Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигает ядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС (программируемая клеточная смерть) в безъядерных системах (цитопластах – клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса ].

Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз – семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты .

На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства

а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5),

б) каспазы-2 (каспаза-2) и

в) каспазы-3 (каспазы 3, 6–10) .

Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений . Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз .

В результате действия каспаз происходит:

1.активация прокаспаз с образованием каспаз;

2.расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым I^CAD или . При апоптозе ингибитор I^CAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется , и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах – 180-200 пар нуклеотидов.

Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК . Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 (протеолиз при Asp 1093) и неидентифицированной протеазы (протеолиз при Ser 987) образуется фрагмент Ser 987 – Asp 1093. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК ;

3.гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;

4.разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;

5.инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК.

(((Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК (см. обзоры [3,11]). Донором ADP-рибозы является NAD⁺. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD⁺, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза. ))))

Существует несколько путей реализации программы ПКС .

Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ’ рецепторы ’ адаптеры ’ каспазы первого эшелона ’ регуляторы ’ каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности Т_Н-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL– лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей TNF. Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин).

Fas – член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов . Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).

Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (– домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD(домен смерти) участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10.