6655-1 (Молекулярные механизмы генетической изоляции)

Молекулярные механизмы генетической изоляции

Б.М. Медников, Е.А. Шубина, М.Н. Мельникова

Дарвин не зря назвал свой главный труд “Происхождением видов”. Он понимал, что видообразование — основной процесс биологической эволюции. Кажется странным, что в биологии нет до сих пор общепринятого определения вида. Все мы понимаем, что лошадь и зебра, твердая и мягкая пшеницы — разные виды. Но попытки дать определение этой структурной единицы классификации, общее для всей живой природы, наталкиваются на серьезные затруднения.

Термин “вид” впервые был предложен еще Аристотелем как совокупность объектов, объединяемых по сходству. Лишь через 2000 лет, в 1693 г., английский натуралист Дж.Рей придал понятию “вид” биологический смысл. Согласно Рею, биологический вид — это совокупность особей, которые объединяются по двум критериям: практической тождественности морфологических признаков и свободному скрещиванию с воспроизведением признаков в потомстве.

Большинство исследователей теперь приходят к выводу, что морфологический критерий для определения вида недостаточен. Генетики склоняются ко второму критерию, исходя из которого следует, что самостоятельность вида поддерживается генетической изоляцией. Н.В.Тимофеев-Ресовский в одной из лекций со свойственной ему экспрессией утверждал, что без генетической изоляции не было бы эволюции — все возникающие виды в результате скрещивания между собой “заболачивались” бы, был бы сплошной scrumbled, Шалтай-Болтай. Не может быть эволюции без генетической изоляции — ограничения обмена генами между возникающими видами. Это утверждение справедливо, однако существуют разные механизмы, препятствующие межвидовому скрещиванию в природе.

Один из таких механизмов — географическая изоляция, т.е. территориальная разобщенность видов. В 1870 г. М.Вагнер пришел к выводу, что в одном ареале может возникнуть лишь один вид, а стало быть, в разных — разные. Такое видообразование он назвал географическим. Теперь его именуют аллопатрическим (allos — другой, patris — родина). Дарвин, однако, допускал, что обмен генами может ограничиваться не только географическим разделением популяций-основательниц.

Иногда в изолированном месте обитания из исходного вида возникают целые “рои”, или, как их еще называют, “букеты” новых видов. Примеры подобного рода — вьюрки Дарвина с Галапагосских островов, рыбы и ракообразные Байкала, цихлидовые рыбы Великих африканских озер. Все они обитают в одном ареале, не скрещиваясь, поскольку у них выработались специальные механизмы генетической изоляции: размножение в разное время, различия в чертах брачного поведения. Как правило, самцы и самки разных видов просто не замечают друг друга. Однако этот барьер легко преодолеть, например, за счет импринтинга (запечатления). Известно, что в Евразии обитают разные виды уток и в природе они практически не скрещиваются. Но если яйцо одного вида утки подложить в гнездо другого, появившийся на свет утенок будет считать себя представителем вида приемной матери, а став взрослой птицей, будет скрещиваться только с особями, к нему принадлежащими. Иногда дело доходит до парадоксов. К.Лоренц писал, что птенец белого павлина, выросший в питомнике рептилий, потом всю жизнь пытался ухаживать за гигантскими черепахами, не обращая внимания на самых красивых пав. Такая изоляция называется прекопуляционной. Разные виды не образуют гибридов и сохраняют свою самостоятельность, потому что просто не спариваются. Этот способ наиболее распространен у высших организмов, в первую очередь у птиц и млекопитающих.

Однако есть многочисленные случаи, когда такой межвидовой барьер отсутствует, но гибриды тем не менее или не образуются, или бывают бесплодны, т.е. стерильны. Классический пример — стерильность мулов (гибридов от осла с кобылой) и лошаков (родившихся от скрещивания ослицы с жеребцом). Больше всего бывает межвидовых гибридов среди растений и низших животных, скажем, рыб. Почему же такие гибриды бесплодны? Генетики раньше полагали, что дело в разном числе хромосом скрещивающихся видов. У осла, например, 62 хромосомы, у лошади — 64, а в зрелых половых клетках — 31 и 32 соответственно. После их слияния в зиготе окажется 63 хромосомы, которые не могут разделиться поровну при образовании гибридных гамет. Поэтому у гибридного потомства половые клетки будут дефектными по числу хромосом, а значит, и нежизнеспособными.

Но это правило далеко не абсолютно. Полная генетическая изоляция между видами с разным числом хромосом вовсе не всегда обязательна. Более того, существуй она, эволюция не могла бы идти — ведь изменение числа хромосом — единичный акт. Если “хромосомная” изоляция была бы абсолютной, особь, подвергшаяся мутации, умирала бы в одиночестве, не оставив потомства.

Мы знаем много разных видов с одинаковым числом хромосом, знаем и внутривидовые формы с разным числом таковых. Свести генетическую изоляцию к колебанию хромосомных чисел не представляется возможным.

В нашей лаборатории уже много лет ведутся работы по поиску какого-нибудь молекулярного критерия вида. Однако все методы, в которых использовалась ДНК, были или недостаточно чувствительными, или чрезмерно трудоемкими. Для целей систематики рекомендовать их было нельзя.

Помощь пришла к нам, когда были открыты рестриктазы — ферменты, расщепляющие нити ДНК по строго определенным участкам нуклеотидной последовательности. Один из таких ферментов — рестриктаза EcoRI (впервые выделенная из бактерии Escherichia coli штамма R). Она расщепляет ДНК на участках ГААТТЦ между гуанином (Г) и аденином (А). После обработки раствора ДНК этой рестриктазой получается смесь фрагментов разной длины, которую разделяют электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле и прокрашивают специальным флуоресцентным красителем. В результате в пленке геля образуется набор полос — своеобразный спектр фрагментов разной длины, которые далее можно идентифицировать, если в том есть необходимость, или сравнивать спектры разных видов.

С помощью такого рестриктазного анализа получено много данных по сходству и различиям отдельных генов, сателлитных и митохондриальных ДНК, ДНК вирусов и бактерий. Однако довольно затруднительно использовать этот метод для выяснения родства организмов по ядерной ДНК. Связано это с тем, что большая часть геномной ДНК животных, растений и грибов представляет собой уникальные нуклеотидные последовательности. Так как места рестрикции в них распределяются нерегулярно, в продуктах расщепления образуется смесь фрагментов, которые четко отделить друг от друга электрофорезом невозможно.

Кроме уникальных последовательностей, в ДНК имеются и многократно повторяющиеся, или просто повторы. Они различаются длиной, расположением в геноме и количеством копий (их бывает от нескольких десятков до миллиона). Именно множественность копий повторяющихся последовательностей делает разделение рестриктазных фрагментов ядерной ДНК успешным. Заметим, функция большинства повторов неизвестна, более того, существует предположение, что они не играют никакой роли. В нашей лаборатории высказывалась гипотеза об их регуляторной функции, которую можно уподобить артиклям, окончаниям и предлогам в письменном тексте.

Первые два автора (Медников и Шубина) разработали метод, позволяющий использовать рестриктазный анализ ядерной ДНК. После предварительного удаления уникальных последовательностей повторы подвергались ферментативному расщеплению и разделению электрофорезом. Этим методом была исследована ДНК тихоокеанских лососей (кеты, горбуши, чавычи, нерки, кижуча и симы) в расчете отыскать показатель, который позволил бы отличить одно нерестовое стадо рыб от другого (т.е. заходящих на нерест в разные реки). Но результат оказался противоположным: набор рестриктазных фрагментов повторяющихся последовательностей ДНК для каждого вида рыб был специфичным и не зависел от пола, возраста и принадлежности к нерестовому стаду. Напрашивался вывод, что найден абсолютный критерий вида — мечта каждого систематика.

В принципе любой вид дальневосточных лососей, вместо длинного морфологического описания, можно охарактеризовать спектром рестриктазных фрагментов. Для кеты он выглядит как Msp1 — 100, 250, 400, 550, 650, 800; Pst1 — 100, 250, 400, 550, 650, 800, 1700; Alu1 — 100, 250, 400, 550, 650, 800 (аббревиатурой обозначены названия рестриктаз, числами — количество пар нуклеотидов, т.е. длина фрагментов). Примечательно, что этот спектр был одинаковым у кеты и из рек Приморья, и из Анадыря. У горбуши он другой: Msp1 — 200, 420, 640; Pst1 1250, 1300, 1700, 2350, 2650; Alu1 — 250, 350, 520, 630, 680.

Результат нас не только удивил, но и огорчил, потому что мы искали генетические различия стад внутри одного вида. Да и в качестве видового критерия спектр оказался мало пригоден, так как его определение по нашей методике было довольно трудоемким. Это, кстати, ахиллесова пята только что разработанных новых методов. Впервые проложенная дорога оказывается самой трудной и нередко забывается.

Наша идея воскресла после работы В.В.Гречко (Институт молекулярной биологии РАН) и А.Н.Федорова (Институт молекулярной генетики РАН), которые предложили более простой способ (он назван методом таксонопринтов), позволяющий изучать распределение фрагментов повторяющихся последовательностей. По этому методу ДНК гидролизуют короткощепящими рестриктазами без отделения уникальных последовательностей от повторяющихся, а образовавшиеся полинуклеотиды метят радиоактивным фосфором (32Р) по концевым остаткам. После этого смесь разделяют электрофорезом, выявляют фрагменты с помощью радиоавтографии и в итоге получают их спектр, или таксонопринт.

Результаты исследования объектов методом таксонопринтов и нашим прежним способом оказались сходными. Какие же молекулярные характеристики вида и популяций нам удалось получить?

Таксонопринты отдельных популяций внутри вида (от рыб и ящериц до человека) идентичны. Не отличаются они и в большинстве географически изолированных популяций. Например у пустынных ушастых ежей спектр фрагментов ДНК одинаков, независимо от того, обитают животные в окрестностях Ашхабада, Кара-Колы или Ташкента [1]. Идентичны таксонопринты кеты, нерестящейся в реках от Анадыря до Приморья; не различаются по этому молекулярному признаку и расы человека.

Но в некоторых случаях спектр фрагментов ДНК внутри одного вида имеет небольшие отличия, к примеру, у хорошо известной лососевой рыбы гольца, распространенной от Северной Европы до Дальнего Востока, а также в Америке. Существуют две формы этого вида — жилая, т.е. пресноводная, и проходная — только заходящая в реки во время нереста. Везде, где есть обе формы (в реках Шпицбергена, на севере Евразии от Норвегии до Таймыра), их таксонопринты идентичны. Но в географически изолированных популяциях Восточной Сибири, где обитают только жилые гольцы, их ДНК уже отличается одним-двумя фрагментами. Это — гольцы из озера Лабынкыр, из озер Забайкалья и Чукотки, а также дальневосточный голец — мальма. Можно заключить, что в географически изолированных ареалах идет постепенное аллопатрическое видообразование [2].

Иное дело, если близкие виды обитают совместно — их таксонопринты отличаются довольно резко. Такие “спектры” различны, например, у живущих в Подмосковье обыкновенного и белогрудого ежей. Мало сходства и в наборе фрагментов ДНК двух видов гольцов, населяющих чукотское озеро Эльгыгытгын,— арктического гольца и малоротой палии, которая, кстати, и по морфологическим признакам отличается от прочих гольцов настолько, что ее выделили в отдельный род Salvethymus.

Все это приводит к мысли, что у симпатрических видов, обитающих совместно и, видимо, совместно возникших, дивергенция быстро проявляется в виде различий таксонопринтов. Но они остаются близкими или даже идентичными у аллопатрических видов, чьи ареалы разделены расстоянием. Хороший пример — американский бизон и европейский зубр. Они произошли от одного вида (Bison priscus), в свое время населявшего огромную территорию — от современной Британии до восточного берега Северной Америки. После того как материки разделились, потомки прежде единого вида накопили немало морфологических различий, но таксонопринты остались идентичными. Кстати, бизон и зубр свободно скрещиваются, и гибриды характеризуются гетерозисом — гибридной мощностью. Легко скрещиваются в неволе, а также на стыках мест обитания и дают плодовитое потомство горные бараны — европейский муфлон, переднеазиатский уриал и центральноазиатский архар, населяющие разные горные системы. Таксонопринты этих видов практически одинаковы [3]. Похоже, что такие виды генетически не изолированы, хотя имеют много различающихся морфологических черт, по которым систематики считают их самостоятельными.

Возникает естественный вопрос: для чего же в геноме существуют повторяющиеся последовательности, которые выявляются методом таксонопринтов? На наш взгляд, эти участки ДНК играют роль маркеров, т.е. распознают гены, которые должны включаться в действие в развивающейся зиготе. Запускают их регуляторные белки, имеющиеся в цитоплазме оплодотворенной яйцеклетки. В сперматозоидах цитоплазмы нет, поэтому нет и этих белков. Если такие фрагменты ДНК одинаковы или очень близки у отца и матери, отцовские и материнские хромосомы работают совместно, обеспечивая нормальное развитие зиготы.

А если различаются? Тогда регуляторные белки яйцеклетки с трудом узнают гены, привнесенные в нее спермием, и их работа оказывается заторможенной, зигота перестает развиваться, гибнет, и мы констатируем случай генетической межвидовой изоляции. Генетики хорошо знают так называемый материнский эффект, за счет которого отцовские гены разных видов или далеко разошедшихся разновидностей включаются в работу поздно или не включаются вообще. С точки зрения классической генетики — это нонсенс, ведь хромосомы обоих родителей равноправны.

Возможен относительно простой эксперимент для подтверждения материнского эффекта. Если в оплодотворенную яйцеклетку межвидового гибрида с помощью микроманипулятора ввести цитоплазму яйцеклетки отцовского вида, материнский эффект будет снят: регуляторные белки цитоплазмы отцовской линии активируют гены отцовского генома. Этим же способом можно стимулировать развитие межвидовых гибридов, которые обычно не возникают. Наконец, цитоплазмой яйцеклетки можно активировать исходные гены для получения клонированного зародыша из недифференцированной соматической клетки.