5282-1 (Генный и хромосомный уровни контроля развития), страница 2

В настоящее время накапливаются данные о "пространственном" контроле транскрипции в индивидуальных хромосомах у разных видов эукариот: дрожжей, дрозофилы и млекопитающих (Cockell, Gasser, 1999; Lyko, Paro, 1999). В дрожжевых клетках инсерция генов в теломерные районы сопровождается репрессией их активности - феномен, напоминающий "эффект положения" у дрозофилы (Grunstein, 1998). В ядре дрожжевой клетки теломерная ДНК формирует компартмент вблизи ядерной оболочки, и там же наблюдается высокая концентрация Sir-белков ("silent information regulator"). При инсерции активного гена вблизи теломеры Sir-белки, образуя комплекс с ДНК, полностью репрессируют его активность. Однако, если нарушается перинуклеарное позиционирование теломеры в результате действия мутаций (генов HDF1 или HDF2 из семейства Ku), то теломеры утрачивают свою репрессирующую активность (феномен "telomeric position effect"). Таким образом, репрессирующее действие теломерного гетерохроматина у дрожжей осуществляется только при условии локализации теломеры вблизи ядерной оболочки. В изящных экспериментах по направленному "заякориванию" трансгена (слитого с геном-репортером) на ядерной оболочке дрожжевой клетки наблюдалась полная репрессия гена-репортера (Andrulis et al., 1998). Авторы заключили, что близость ядерной оболочки способствует репрессии генов у дрожжей, но происходит это при участии Sir-белков, создающих центры нуклеации.

В настоящее время накоплен значительный экспериментальный материал о трехмерной организации интерфазного ядра эукариот, в основе которой лежит дифференциальное позиционирование различных районов хромосом как относительно друг друга, так и ядерной оболочки, что предположительно оказывает существенное влияние на экспрессию генов (Cockell, Gasser, 1999; Misteli, 2001; Gasser, 2002; Parada, Misteli, 2002). В архитектуре ядра ключевым моментом является разделение его на территории, соответствующие индивидуальным хромосомам (Zink, Cremer, 1998; Zink et al., 1998; Edelman et al., 2001). В свою очередь хромосомные территории разбиты на субхромосомные домены (размером примерно 1 Мб) (Zink, Cremer, 1998; Zink et al., 1998). По данным Sadoni et al. (1999), хромосомные территории поляризованы так, что в одних компартментах находятся ранореплицирующиеся (ближе к центру ядра), а в других - позднереплицирующиеся районы хромосом (по периферии ядра, в перинуклеолярной зоне), которые соответствуют R- и G/C-сегментам митотических хромосом (подробнее о R- и G/C-сегментах рассмотрим ниже). Согласно данным Croft et al. (1999) и Cremer et al. (2001), хромосомы с низкой плотностью генов (хромосома 18) предпочтительно локализуются по периферии ядра, а с высокой (хромосома 19) - во внутренних районах интерфазных ядер. Позднее было показано, что расположение хромосом с высокой и низкой плотностью в разных компартментах интерфазного ядра характерно для всех хромосом человека (Boyle et al., 2001). Интересно отметить, что локализация хромосом 18 и 19 в разных компартментах наблюдается у всех приматов Старого Света (Tanabe et al., 2002). По мнению авторов, такой эволюционный консерватизм в пространственной организации хромосом в интерфазном ядре предполагает, что эта форма организации может играть важную роль в функционировании генома. Ранее Стегний (1993) высказал идею, что изменения в архитектонике интерфазного ядра путем изменения позиции хромосом могут играть важную роль в видообразовании. К этому следует добавить, что согласно данным Sun et al. (2000), теломеры больших хромосом локализованы на периферии ядра, тогда как теломеры более мелких хромосом находятся ближе к центру. Таким образом, есть все основания утверждать, что хромосомы неслучайным образом организованы в интерфазном ядре. Более того, хромосомные территории устойчивы и воспроизводятся в дочерних клетках после митоза, а хромосомные компартменты закреплены структурно посредством связей с различными элементами интерфазного ядра (Chubb et al., 2002; Parada, Misteli, 2002).

Данные о пространственной организации хромосом в интерфазных ядрах рассматриваются некоторыми авторами как фактор в регуляции отдельных генов и генома в целом (Cockell, Gasser, 1999; Lyko, Paro, 1999; Parada, Misteli, 2002). Выше были приведены примеры "пространственного" контроля в регуляции генов у дрожжей и генов бета-глобинового кластера у млекопитающих. Важно также отметить, что такой контроль имеет место и при клеточной дифференцировке. Так, согласно данным Brown et al. (1997), при дифференцировке В-лимфоцитов гены CD2, CD4, CD8 alpha, CD19, CD45 lambda5 перемещаются в ядре в места скопления гетерохроматина ("heterochromatin-containing foci"), в результате чего их экспрессия подавляется. Связь неактивных генов с гетерохроматином осуществляется с помощью белка Ikaros, который специфически связывается с промоторами генов и тем самым "рекрутирует" их в состав гетерохроматина (Brown et al., 1997; 1999; Cobb et al., 2000). Эти данные свидетельствуют, что хромосомный контекст (близость гетерохроматина) и пространственные перемещения отдельных районов хромосом в интерфазном ядре действительно могут играть важную роль в контроле экспрессии генов.

В свете приведенных выше данных уместно рассмотреть последствия изменений в позиции генов в хромосомах на их экспрессию. Действительно, имеется экспериментальный материал о влиянии хромосомных перестроек на генную активность. Например, анализ экспрессии гена Pgd (6-фосфоглюконат-дегидрогеназа), вовлеченного в 21-ю хромосомную перестройку, показал, что в 2 случаях она была полностью утрачена, в 10 - заметно снижена, в 3 - наблюдалось повышение активности и в 6 - не отмечено эффектов перестройки (Slobodyanyuk, Serov, 1983). Несомненно, наиболее ярким примером эффекта хромосомных перестроек является ставший хрестоматийным феномен "эффекта положения гена", при котором прилежащий в новой позиции гена гетерохроматин вызывает полную его инактивацию или сайленсинг либо во всех соматических клетках, либо только в части клеток (эффект положения мозаичного типа). Этому феномену посвящен ряд исчерпывающих обзоров, в которых суммированы многолетние исследования по влиянию гетерохроматина на экспрессию близлежащих генов (Tarlof et al., 1984; Жимулев, 1993; Weiler, Wakimoto, 1995; Zhimulev, 1998).

Следует отметить, что долгое время считалось, что феномен "эффект положения" свойственен только семейству Drosophilidae. Однако с развитием технологии получения трансгенных животных и растений стало очевидным, что сходные явления наблюдаются у других животных и даже растений. Основным способом получения трансгенных животных является инъекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус зигот. При таком способе чужеродная ДНК интегрируется в реципиентный геном случайным образом, и, таким образом, каждое трансгенное животное независимого происхождения является уникальным относительно хромосомной локализации трансгена (Palmiter, Brinster, 1986).

Уже в ранних работах по трансгенезу была отмечена необычайно широкая вариабельность в экспрессии трансгенов: от полного ее отсутствия до уровня, сходного с эндогенным геном (Palmiter, Brinster, 1986). В большинстве случаев уровень транскрипции трансгенов не зависит от числа копий в геноме трансгенных животных. С учетом случайного характера интеграции трансгенов было предположено, что вариабельность экспрессии определяется хромосомным контекстом в месте локализации трансгена. Долгое время считалось, что эта вариабельность определяется исключительно уровнем транскрипции трансгена (Palmiter, Brinster, 1986; Transgenic animals, 1992). Однако позднее было показано, что в основе этой вариабельности чаще всего лежит мозаицизм, и экспрессия зависит от соотношения клеток с активным и неактивным трансгеном (Porter, Meyer, 1994; Robertson et al., 1995; Dobie et al., 1996; Festenstein et al., 1996). Эти данные были получены на трансгенных животных и растениях с использованием генов-репортеров бета-галактозидазы E. coli или "зеленого" белка (GFP) под контролем конститутивных или тканеспецифических промоторов (Ramirez et al., 2001).

Мозаичная экспрессия у трансгенных животных несомненно имеет сходство с эффектом положения гена у дрозофилы, поскольку в основе обоих феноменов лежит принцип "все или ничего". Любопытно, что формирование тканевого мозаицизма у трансгенных мышей имеет сходство с таковым у химерных животных, что предполагает сходные временные закономерности (Morley et al., 2002). Также общим свойством является индукция устойчивого сайленсинга трансгена в тех случаях, когда место его интеграции расположено по соседству с гетерохроматином (Dobie et al., 1996; Festestein et al., 1996), хотя имеются примеры мозаичной экспрессии трансгенов, находящихся на удаленном расстоянии от центромерного гетерохроматина (Ramirez et al., 2001). Это натолкнуло на идею, что мозаичная экспрессия трансгенов может быть связана с локальной гетерохроматизацией, индуцированной повышенной их копийностью (Dorer, Henikoff, 1994; Garrick et al., 1998). Однако описаны случаи, в которых мозаицизм наблюдался у животных с единичными копиями трансгена (Zhuma et al., 1999; Ramirez et al., 2001). Следует также отметить, что мозаичность в экспрессии трансгенов устраняется присутствием в нем LCR (Locus Control Region) (Kioussis, Festenstein, 1997; Ramirez et al., 2001).

Другим важным аспектом, на котором имеет смысл остановиться в связи с выяснением роли хромосомного контекста, является эктопическая экспрессия трансгенов, находящихся под контролем ткане- специфических промоторов (Palmiter, Brinster, 1986). Первоначально предполагалось, что эктопическая экспрессия может возникать из-за того, что используемые промоторы не содержат всех регуляторных последовательностей, необходимых для правильной тканеспецифической экспрессии. Позднее были получены данные, в которых оценена роль места интеграции трансгена в появлении его эктопической экспрессии. Например, промотор ретинолсвязывающего белка, слитый с геном-репортером бета-Gal, обеспечивал правильную экспрессию трансгена (в клетках печени) у 3 трансгенных животных, тогда как у 4-го животного экспрессия не наблюдалась в печени, но обнаруживалась в постимплантационный период в сомитах и ромбомерах заднего мозга эмбриона (Tan, 1991). Более того, у взрослых потомков этого основателя экспрессия была выявлена в лицевых мышцах и неокортексе. Таким образом, фланкирующие последовательности в месте интеграции трансгена у одного из животных изменили как время экспрессии в онтогенезе, так и тканеспецифичность (Tan, 1991). Другой пример: среди трансгенных мышей, полученных введением конструкции, содержащей промотор гена кератина 18, слитого с геном-репортером бета-Gal, было выявлено животное, у которого правильная экспрессия (в печени) наблюдалась только в случае наследования трансгена от матери и эктопическая (в мезодерме эмбриона и сетчатке глаза) при наследовании от отца (Thorey et al., 1992). Важно отметить, что интеграция этого трансгена произошла в место, не связанное с эндогенным импринтингом (Thorey et al., 1992). К этому следует добавить, что гены-репортеры, находящиеся по контролем "слабых" промоторов (например, herpes simples virus), экспрессируются уникальным образом у трансгенных животных независимого происхождения (Allen et al., 1988). Это заключение справедливо как для времени активации в развитии, так и тканевой специфичности экспрессии трансгенов у взрослых животных. Таким образом, многочисленные данные, полученные на трансгенных животных, позволяют заключить, что временные и пространственные параметры экспрессии трансгенов находятся под значительным влиянием хромосомного контекста. Из этого следует заманчивое предположение, что потенциально хромосомные перестройки могут модифицировать временные и пространственные параметры экспрессии генов, вовлеченных в эти перестройки. В настоящее время не вызывает сомнений важность хромосомного уровня регуляции генов в развитии. Учитывая, что интенсивность исследований этого уровня регуляции стремительно нарастает в последнее десятилетие, можно ожидать в ближайшие годы новых открытий в одной из самых значительных проблем современной биологии - проблеме индивидуального развития.

Список литературы

1. Жимулев И.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена. Новосибирск: Наука, 1993. С. 490.

2. Стегний В.Н. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1993.

3. Adams M.D., Celniker S.E., Holt R.A. et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster // Science. 2000. V. 287. P. 2185-2195.

4. Allen N.D., Cran D.G., Barton S.C. et al. Transgenes as probes for active chromosomal domains in mouse devel-opment // Nature. 1988. V. 333. P. 852-855.

5. Andrulis E.D., Neiman A.M., Zappulla D.C., Sternglanz R. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcrip-tional silencing // Nature. 1998. V. 394. P. 592-595.

6. Bonifer C. Developmental regulation of eukaryotic gene loci: which cis-regulatory information is required? // Trends Genet. 2000. V. 16. P. 310-315.

7. Boyle S., Gilchrist S., Bridger J.M. et al. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 211-219.

8. Brown K.E., Baxter J., Graf D. et al. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division // Mol. Cell. 1999. V. 3. P. 207-217.