169608 (Кинетические методы определения загрязнителей в различных природных средах), страница 3

E + S ES P + E,

где Е - фермент, S - субстрат, ES - промежуточный комплекс фермента с субстратом (комплекс Михаэлиса-Ментен), Р - продукт. Концентрация субстрата [S]0 будет пропорциональна u0 только при условии, когда [S]0 ! Km . Тогда

[S]0 = u0Km / kкат[E]

Следовательно, верхняя граница определяемых концентраций субстрата ограничена величиной константы Михаэлиса-Ментен (Km). Нижняя граница определяемых концентраций субстрата определяется той величиной u0 , которая может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения инструментального метода, причем величина u0 тем выше для одного и того же значения [S]0 , чем выше kкат и [E]. Таким образом, использование высокоактивного фермента (большое значение kкат) и повышение его концентрации в реакционной смеси могут существенно снизить предел обнаружения субстрата.

Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при определении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.

Для контроля начальной скорости ферментативного процесса или концентрации продукта реакции могут быть использованы практически любые доступные исследователю физико-химические методы. Наиболее часто применяют фотометрические методы индикации. При этом в качестве индикаторных часто используют, например, катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющие контролировать скорость ферментативных реакций с участием, например, люциферазы. Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия) наиболее удобны для контроля скорости реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода, образованием Н О и т.д. Ферментные электроды, в которых фермент механически или ковалентно включают в полупроницаемую полимерную мембрану, покрывающую электрод, позволяют специфически определять различные органические и неорганические соединения без введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов.

К настоящему времени разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов ферментов: неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, P-, O-содержащих) соединений. При этом можно выделить ферменты, позволяющие определять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальное соединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты (субстраты этого фермента), алкогольоксидазы - первичные спирты, арилалкогольоксидазы - ароматические первичные спирты. Следует отметить, что методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружения многих органических веществ - субстратов ферментов лежат в интервале 10- 6-10- 4 М, а органических эффекторов - 10-11-10- 8 М. Кроме того, число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.

2. 2. Определение органических соединений

Ферментативные методы определения органических соединений успешно разрабатываются и применяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологически активных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара (в частности, глюкоза), спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики.

Ферментативное определение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментом уреазой. Образующиеся продукты гидролиза - ионы и можно определять электрохимически, фотометрически или флуориметрически. Групповое определение аминокислот основано на использовании таких ферментов, как L-амино- или D-аминооксидаза, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздуха до кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Последний далее определяют электрохимически с помощью NH3-чувствительного газового электрода. Специфическое определение отдельных аминокислот возможно при применении декарбоксилаз, дегидрогеназ, лиаз, трансфераз. Для определения глюкозы используют несколько специфических ферментативных реакций, например: 1) катализируемое глюкозооксидазой окисление ее кислородом воздуха (или другими окислителями) до глюконовой кислоты и пероксида водорода; 2) ее взаимодействие с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы. При использовании первой реакции определение глюкозы проводят либо наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительного электрода Кларка, либо измеряя рН раствора, который изменяется вследствие образования глюконовой кислоты, либо определяя количество образовавшегося пероксида водорода. Ферментативные методы определения сахарозы и других дисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы, лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых является глюкоза. Далее глюкозу определяют с помощью описанного выше метода. Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двух ферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородом воздуха до ацетальдегида и Н2О2 , или алкогольдегидрогеназы, в присутствии которой спирт в реакции с НАД (никотинамидадениндинуклеотидом) превращается в НАД " Н2 .

Определение различных токсичных соединений, таких, как фенолы, ароматические амины, фосфор-, сероорганические соединения, является важной задачей аналитической химии и в первую очередь связано с проблемами контроля и охраны окружающей среды.

Некоторые токсичные соединения являются субстратами специфических ферментов, что позволяет значительно упростить подготовку проб сложных по составу объектов анализа. Например, определять мочевину в воде плавательных бассейнов, почве позволяет использование уреазы, для которой мочевина является высокоспецифическим субстратом.

Однако в большинстве предложенных методов для определения токсичных соединений используют их ингибирующее действие на ферменты. Например, фосфорсодержащие пестициды определяют по ингибированию холинэстеразы или карбоксилэстеразы; серосодержащие ингибиторы, различные фенолы - с помощью пероксидазы; по ингибированию свечения бактериальной люциферазы определяют инсектициды: ДДТ, пентахлорфенол. Для определения фунгицидов и инсектицидов в плодах, ягодах, листьях применяют папаин, ацетилхолинэстеразу.

2. 3. Определение неорганических соединений

Ферментативные методы успешно применяют для чувствительного и селективного определения ионов металлов, неорганических анионов, пероксида водорода, кислорода, растворенного в воде. Многие ионы металлов (например, Ag, Cu, Hg, Zn, Bi, Cd) можно определять с применением ферментов в количествах, недоступных определению с помощью большинства физико-химических методов анализа. Так, с применением щелочной фосфатазы разработан метод определения нанограммовых количеств бериллия. По ингибирующему действию на алкогольдегидрогеназу возможно определять ионы серебра в концентрации 10 пг/мл. Предложенные методы определения ртути по ингибирующему действию на пероксидазу и уреазу являются одними из самых чувствительных методов. Важно отметить, что приведенные методы являются не только высокочувствительными, но и селективными. Обычно же методы, основанные на ингибирующем или активирующем действии ионов металлов на фермент, не отличаются высокой селективностью. Однако избирательность методов можно повысить при использовании обычных для аналитической химии приемов маскирования.

Наиболее чувствительными и селективными являются ферментативные методы определения ионов металлов по реактивации апофермента (белковой части фермента). Так, для определения цинка и кальция использована реактивация апофермента, полученного удалением ионов цинка из щелочной фосфатазы. Чувствительный и селективный метод определения меди основан на реактивации апофермента, полученного диализом иммобилизованной полифенолоксидазы.

Для определения анионов, таких, как CN-, чаще всего используют ферментные электроды, позволяющие проводить экспрессный анализ сложных промышленных и биологических объектов. Как правило, в ферментных электродах применяют иммобилизованные ферменты. Чаще всего анионы являются субстратами в тех ферментативных реакциях, которые положены в основу методов их определения. Пределы обнаружения анионов при использовании ферментных электродов обычно выше 10 мкМ. Следует особо выделить высокочувствительные методы определения таких физиологически активных анионов, как CN-, I-, S2 -, F -, основанные на их реактивирующем действии на инвертазу, ингибированную ртутью или серебром (с пределами обнаружения 0,2-10 нг/мл), а также на ингибирующем действии на пероксидазу и кислую фосфатазу.

Определение других неорганических соединений - аммиака, кислорода, диоксида серы, пероксида водорода основано на том, что они являются субстратами многих ферментов и, следовательно, могут быть определены с их помощью.

Расширению применения ферментов в аналитической химии способствуют дальнейшее развитие энзимологии, разработка новых способов стабилизации ферментов, выделение и исследование новых ферментов.

ГЛАВА 3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Исследование влияния неблагородных металлов на кинетическое определение родия

Развитие аналитической химии малых содержаний платиновых металлов может быть связано с совершенствованием кинетических методов их анализа. Родий - один из элементов группы платиновых металлов, число индикаторных реакций для определения которого кинетическим методом невелико. Наиболее избирательной и чувствительной (2 10^-4 мкг/мл Rh) является реакция окисления меди (II) периодат-ионом с образованием окрашенного периодатного комплекса меди (III) в щелочной среде (pH=8,3 - 8,5,  =400 нм), которая лежит в основе кинетического определения родия методом тангенсов. Определению родия не мешают 20-кратный избыток платины, палладия, иридия и золота, что вполне устраивает аналитиков, если речь идет об анализе технологических растворов. Однако, такие растворы содержат большие количества железа (1:13000), калия (1:400) и натрия (1:26000). Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что железо (III) уже в количествах в 25 раз превышающих содержание родия искажает результаты анализа, а данные о мешающем влиянии натрия и калия вообще отсутствуют.

В данной работе исследовались различные методы устранения мешающего влияния железа (III) на указанную выше кинетическую реакцию и исследовалось мешающееся влияние натрия и калия. Нами установлено, что описанные в литературе методы маскирования железа (III) фосфат- и фторид- ионами, лимонной, винной кислотами неэффективно в оптимальных условиях кинетического определения родия. Следовательно, для анализа таких растворов необходима предварительная стадия переведения железа в малорастворимое соединение с целью отделения от родия, причем на этой стадии весь родий должен оставаться в растворе. При осаждении гидроксида железа 2 М раствором гидроксида натрия 86,7 % родия увлекается в осадок, а при осаждении 25%-ным раствором аммиака, в осадок переходит 76,7 % родия и лишь использование еще более слабого основания (нитрата натрия) позволяет в достаточной мере достигнуть переведения железа в осадок без осаждения родия.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ПЕРСУЛЬФАТА АММОНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КИНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА

Как известно, персульфат аммония используется в практике аналитической химии, в том числе при анализе различных цветных сплавов, стали и чугунов. Кроме того, важен вопрос аналитического контроля продуктов получения персульфата аммония, производство которого стало необходимым в последнее время по следующим причинам. В технологии аффинажа платиновых металлов для очистки палладия от платины требуется сильный окислитель, как им и является персульфат аммония в аммиачной и нейтральной средах. Товарная его форма в виде соли или раствора обеспечивает удобство применения его по сравнению с другими окислителями. Несмотря на широкий круг потребителей в других отраслях промышленности выпуск персульфата аммония в России прекращён и поставки его обеспечивается только импортом. Поэтому остро стоит задача разработки технологии производства и анализа данного реагента на месте его потребления.

Для определения малых количеств (10-60 мкг) персульфат-иона использовали кинетический метод со спектрофотометрическим контролем иодометрической реакции. Светопоглощение измеряли при постоянном значении рН, равном 6.85 (регулируемый показатель кислотности реакции) и при длине волны 364 нм. Кинетические кривые зависимости .оптическая плотность-время обрабатывали методом тангенсов. Содержание персульфата аммония определяли методом градуировочного графика (зависимость tg- концентрация определяемого вещества). Для определения персульфата аммония в интервале 50-260 мкг использовали описанный выше метод, но следует заметить, что нарастание оптической плотности, связанное с выделением йода, происходит очень быстро: в течение 3 минут при концентрации 0.2 мг. Поэтому при концентрациях 0.25-0.75 мг вещества в описанной выше методике использовали тиосульфат натрия в качестве замедлителя. Относительная погрешность определения не превышала 3%.

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ НЕФТЯНОЙ

ИНТОКСИКАЦИИ СЕГОЛЕТОК РУССКОГО ОСЕТРА

Для оценки и прогноза изменений состояния природных экосистем широко используются непрерывные или регулярные измерения их физических, химических и биологических параметров, лежащие в основе экологического мониторинга. Между тем экосистемы достаточно долго сохраняют "следы" прошлого, с помощью которого можно не только реконструировать пройденный ими путь развития, но вкупе с оценкой текущего состояния также составить прогноз того, что их ожидает в будущем. Такие исследования мы называем экологической диагностикой, поскольку в отличие от экологического мониторинга они могут носить единовременный характер. Наибольших успехов экологическая диагностика достигла в области биохимии и физиологии – последствия перенесенных организмами стрессов порой ощущаются в течение всей их жизни. По нашему мнению, широкие возможности для развития экологической диагностики открывает также биотестирование, если оно сочетается с изучением кинетических закономерностей воздействия внешних факторов на биологические системы.