169608 (Кинетические методы определения загрязнителей в различных природных средах), страница 2

Рис. 2. Кинетические кривые окисления KI (2  10^–4 М) пероксидом водорода (2,4 * 10^–3 М), катализируемого Ti(IV), в присутствии крахмала

За изменением концентрации индикаторного вещества во времени можно наблюдать любым методом, и при построении кинетических кривых вместо концентрации образующегося продукта использовать любую, пропорциональную ей величину — оптическую плотность, силу тока, потенциал системы и т. д. Чаще всего для наблюдения за скоростью индикаторной реакции используют спектрофотометрические и люминесцентные, реже — электрохимические, термометрические и титриметрические методы.

Некаталитические методы не отличаются высокой чувствительностью (она определяется, как правило, методом наблюдения за скоростью индикаторного процесса), но они селективны, часто позволяют определять в смеси близкие по свойствам вещества без их предварительного разделения. Эти методы применяют при анализе смесей органических соединений (спиртов, сахаров, аминов) и смесей таких близких по свойствам ионов металлов, как щелочно-земельные и редкоземельные элементы.

Каталитические методы анализа отличаются высокой чувствительностью, которая для многих неорганических веществ сравнима с чувствительностью масс-спектральных и активационных методов анализа, а для органических — с наиболее чувствительными вариантами хроматографии. В отдельных случаях, например, для серебра, хрома, кобальта, каталитические методы — наиболее чувствительные из всех известных методов анализа. При этом преимуществом каталитических методов является сочетание высокой чувствительности с простотой аппаратурного оформления и методики проведения анализа.

Среди каталитических методов высокую чувствительность и селективность имеют ферментативные методы, основанные на использовании реакций, катализируемых ферментами. Ферментативными методами определяют субстраты, сами ферменты и эффекторы ферментов (соединения, мешающие активности ферментов). Методы определения субстратов — веществ, на которые действуют ферменты — высокоселективны и даже специфичны, что позволяет определять субстраты непосредственно в матрице сложных объектов (кровь, биомассы и биожидкости, многокомпонентные технологические растворы). Чувствительность определения при этом обусловлена методом, выбранным для контроля за скоростью процессов. Часто в этих случаях используют ферментные электроды. Методы определения эффекторов ферментов высокочувствительны, но не всегда селективны.

В кинетических методах наиболее часто используют метод тангенсов как наиболее точный (использует большое число экспериментальных данных) и универсальный (применим для реакций с индукционным периодом). Реже применяют способ фиксированного времени и способ фиксированной концентрации, хотя эти способы более просты и менее трудоемки. Способ фиксированной концентрации используют обычно при автоматизации контроля, способ фиксированного времени — при проведении серийных анализов.

Метод каталиметрического титрования применяют для определения с повышенной точностью микросодержания ионов металлов или органических соединений, образующих с ионом металла устойчивые, каталитически неактивные комплексы, и следов органических веществ в неорганических солях особой чистоты. При титровании органического соединения избыток титранта (иона металла-катализатора) уже в концентрации 10^–8–10^–6 М вызовет протекание каталитической реакции и тем самым определит конечную точку титрования .

Основное применение каталитических методов в анализе реактивов и веществ особой чистоты — определение микроконцентраций переходных металлов. Именно каталитические методы позволяют определить ионы элементов, содержание которых часто лимитируется в технических условиях на вещества особой чистоты табл. 1.

Чистота цитирования примесей* в веществах особой чистоты [16] и пределы обнаружения их каталиметрическими методами

 Чаще всего лимитируется содержание железа и меди (допустимый уровень — 10^–4–10^–6%). Другие примеси определяют реже, но для некоторых веществ необходим контроль их содержания на уровне 10^–7%, который не обеспечивается традиционными методами эмиссионной спектроскопии и спектрофотометрии. Особенно успешно каталитические методы применяются для определения Co, Mn, V, Mo, W, Nb, Ta. Кроме того, при анализе веществ особой чистоты каталитические методы позволяют определять отдельные анионы, органические соединения в неорганических солях, отклонения от стехиометрии в составе соединений.

Нижняя граница концентраций, определяемых с применением каталитических методов, для большинства элементов составляет 10^–8–10^–9 М (10^–3–10^–4 мкг/мл), т. е. на 1–2 порядка ниже, чем в методах спектрофотометрии, полярографии и пламенного варианта атомной абсорбции.

Скорость конкретной индикаторной реакции зависит от многих параметров: температуры, ионной силы раствора, концентрации мешающих компонентов, наличия ингибиторов и активаторов. Все эти параметры в кинетических методах анализа необходимо строго контрфолировать и поддерживать постоянными для получения надежной аналитической информации.

Каталитическая реакция является результатом протекания ряда элементарных процессов, поэтому влияние температуры на скорость процесса не всегда легко интерпретировать. Для практической оценки влияния температуры на скорость реакции используют температурный коэффициент , который показывает, во сколько раз увеличивается скорость реакции при возрастании температуры на 10 К:

,

Кинетическим определениям могут мешать посторонние ионы и соединения:

• обладающие каталитической активностью;

• снижающие скорость каталитической реакции или изменяющие направление ее отдельных стадий. Мешающее влияние оказывают окислители и восстановители, взаимодействующие с реагентами индикаторной реакции и катализатором: Mn(VII), Cr(VI), I₂, , , HS ; анионы и соединения, образующие с катализатором каталитически неактивные комплексы — F , , NH₃, , ЭДТА; ионы переходных металлов, проявляющие каталитическую активность — Fe, Cu, Mn, Ti, Co; ионы металлов, образующие комплексы с реагентами и продуктами реакции — Al, Bi, Zr, Ti, TR и др.; ингибиторы и активаторы — в основном органические вещества, взаимодействующие с промежуточными продуктами реакции или с катализатором — оксалаты, фенолы, нафтолы, амины, а также инертные электролиты (например, нитраты и перхлораты щелочных металлов) и вещества, обладающие буферным действием.

Избирательность индикаторных реакций характеризуется максимально допустимым содержанием посторонних ионов, при которых относительная погрешность определения анализируемого вещества не превышает заданного значения, например, 0,1.

Кислотность раствора влияет на избирательность определения, если в лимитирующей стадии индикаторной реакции участвует ион водорода, а также в случае образования в результате гидролиза при разных значениях рН гидроксокомплексов, обладающих различной каталитической активностью. Так, каталитически активные комплексы Ti образуются при рН = 3,8, а максимальное содержание каталитически активных и наблюдается при рН = 1,1 и pH = 2,2, соответственно.

Для устранения мешающего влияния посторонних компонентов применяют традиционные для аналитической химии приемы отделения или маскирования мешающих примесей.

Кинетические методы (в том числе и ферментативные) при условии строгого соблюдения условий проведения анализа не уступают другим методам по точности, достаточно экспрессны, легко поддаются автоматизации. В практике аналитической химии эти методы применяют:

• при анализе смесей близких по свойствам органических соединений (некаталитический вариант);

• при определении микроколичеств ионов 3d-элементов, группы платиновых металлов, ряда анионов (I , Cl , Br ) и органических веществ в природных и промышленных объектах;

• при определении присутствия токсичных и лекарственных препаратов, физиологически активных соединений в биологических объектах и объектах окружающей среды (ферментативные методы).

ГЛАВА 2. НЕКОТОРЫЕ ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие химические реакции в живых организмах и вне их. Ферменты обладают уникальными свойствами, которые выделяют их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного типа. Прежде всего это необычайно высокая каталитическая активность. Так, добавка незначительной концентрации фермента (10- 9-10- 7 М) ускоряет превращение субстрата в 108-1012 раз. Другое, не менее важное свойство ферментов - специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях. Эти свойства ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка и весьма сложным механизмом их действия.

Превращение субстрата происходит на активном центре фермента. Для многих ферментов, состоящих из субъединиц, характерно наличие регуляторного участка, который взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента, - активаторами, ингибиторами или инактиваторами (рис. 4).

Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать при их практическом использовании, является стабильность, то есть способность сохранять каталитическую активность. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация - перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитической активности. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно повышают экономичность ферментативных методов анализа.

2. 1. Возможности ферментативных методов анализа

Пределы обнаружения веществ, определяемых ферментативными методами (субстратов, активаторов, обратимых и необратимых ингибиторов и инактиваторов ферментов) зависят не только от каталитической активности фермента, но и от других кинетических характеристик используемой индикаторной реакции. Фермент катализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата. Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса-Ментен