166712 (Анализ биологических тканей и жидкостей)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО НАУКЕ И ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра аналитической химии

Курсовая работа

«Анализ биологических тканей и жидкостей»

Выполнила: студентка 4 курса

Химического факультета

Ругалева Юлия

Преподаватель: старший преподаватель

Аликина Екатерина Николаевна

Пермь 2010г.

Содержание

Введение

Клинический анализ

Фармацевтический анализ

Анализ биоматериалов с помощью ЯМР

Масс-спектрометрические методы в биомедицинских исследованиях

Иммунохимические методы

Электроаналитические методы в биомедицинских исследованиях

Заключение

Список литературы

Введение

Химия всегда была связана с медициной, а в XVI-XVII в.в. практически целиком «работала» на нее (период ятрохимии). Многие химики тех времен были по образованию, а иногда и по роду занятий, врачами – Парацельс, Я.Б. Ван Гельмонт, Г.Э. Шталь, К.Л. Бертолле, А.П. Бородин и прочие. В первую очередь химию использовали для получения лекарств, но химические подходы со временем все больше применяли и в целях диагностики, а это уже ближе к химическому анализу.

Постепенно сложились следующие направления анализа медицинских объектов:

- клинический анализ – исследование состава крови, мочи и др.;

- фармацевтический анализ – анализ лекарственных объектов.

К менее распространенным медицинским исследованиям можно отнести поиск и определение новых маркеров заболеваний, фармакокинетику (изучение миграции и изменений лекарственных веществ в организме), допинг-контроль спортсменов, ДНК-анализы и др.

Целью данной работы является обобщение имеющихся данных об анализе биологических тканей и жидкостей, применяемом в медицине, а также выявление основных направлений развития этой области аналитической химии.

Клинический анализ

Аналитическая химия довольно длительное время не уделяла внимания медицинским и биологическим объектам. Методический уровень медико-биологических исследований, которыми занимались врачи или биологи, с точки зрения профессионала-аналитика был (а иногда и остается) довольно низким. В конце XX века в исследования медицинского назначения включается все болье и больше аналитических лабораторий. Этот процесс особенно характерен для США, где на биомедицинские исследования выделяются ограмные средства. За это время были разработаны новые методы, прежде всего, метод иммуноанализа. В журналах по аналитической химии постоянно растет число публикаций, посвященных иследованию медицинских объектов.

В медико-биологических исследованиях методы локального анализа не менее важны, чем определение валовых показателей химического состава.

Отдельное направление клинического анализа – токсикологические исследования. В области обнаружения ядов эти исследования смыкаются с криминалистическими. Необходимость обнаружения ядов (например, соединений мышьяка и ртути) с древних времен способствовало развитию аналитических методов. Крупными достижениями стали, например, методики обнаружения следов мышьяка, связанные с образованием и разложением арсина (реакция Марша). В руководствах по токсикологии и судебной химии всегда приводились (обычно без теоретического обоснования) методики обнаружения ядовитых веществ. Еще больше писалось об этом в газетных репортажах и детективных романах.

Обнаружение и определение веществ, являющихся маркерами заболеваний или индикаторами состояния органов человека, создание для этого новых приемов и устройств – очень интересная для аналитика область. На определении химических маркеров (точнее сказать, показаителей, характеризующих химический состав) в значительной степени и основывается клинический анализ. Исследования здесь осуществляются в двух направлениях: первое – отыскание новых маркеров и создание методов их регистрации, второе – разработка новых методик обнаружения и определения веществ, биологическая роль которых уже известна. Аналитики больше зщанимаются работами по второму направлению. Биологические и биомедицинские исследования требуют нестандартных аналитических решений. Это, в частности, диагностика заболеваний путем обнаружения и определения их биомаркеров в моче, крови, потовых выделениях, в тканях. Так, немало эффективных инструментальных методов разработано для определения глюкозы в крови диабетиков. Эти анализы теперь делают не только в лаборатории, но и в любых удобных для больного условиях. Созданы средства, требующие для этой цели всего несколько микролитров крови. Однако повышение концентрации глюкозы может быть выяснено и косвенно – по повышенному содержанию ацетона в выдыхаемом воздухе.

Клиническим анализом заняты тысячи сотрудников контрольно – аналитических лабораторий медицинского профиля. Так, в каждой крупной клинической лаборатории ежедневно анализируют несколько десятков однотипных проб крови и мочи на сахар. Обычно они выполняются строго по стандартной методике, предусматривающей введение в пробу ряда реагентов и измерение оптической плотности полученного раствора (спектрофотометрия). Проводить сотни подобных анализов вручную – утомительный, нетворческий труд, да и не всегда лаборант, работая вручную, может обеспечить необходимую точность результатов. В последние десятилетия появились автоматические устройства для ускорения и повышения точности массовых лабораторных анализов.

На сегодняшний день наиболее распространенными методами в клиническом анализе являются иммунохимические, электроаналитические, ЯМР, хромато-масс-спектрометрические. Ниже некоторые из них рассмотрены подробнее.

Фармацевтический анализ

Анализ лекарственных веществ в ходе их производства, хранения, распространения – это, строго говоря, не собственно медицинский, а либо способ контроля технологических процессов, либо сертификационный анализ. Но все-таки лекарства – средства лечения, поэтому уместно будет рассмотреть его в этой работе.

История анализа лекарственных средств, сначала природного происхождения, а затем и синтетических начинается много веков назад. В аптеках работали К. Шееле, К.М. Клапрот, Т.Е. Ловиц, Ю. Либих, Ф. Мор и многие другие крупные химики. Любой провизор наряду с изготовлением лекарственных препаратов занимался проведением анализов: исследовал состав сырья, проверял качества готовых лекарств и т.д.). Для этой цели в аптеках использовали всевозможные химические, а затем и инструментальные методы.

Наиболее распространенным методом в анализе лекарств сегодня стала высокоэффективная жидкостная (отчасти – тонкослойная) хроматография.

Многие лекарственные вещества (а также пищевые добавки) используют в форме рацематов, между тем разные их составляющие (энантиомеры) могут проявлять различные полезные или вредные свойства. Уже давно стоит задача использовать, по возможности, наиболее действенную форму, что стимулировало разработку методов стереоселективного синтеза, эффективных приемов разделения рацематов и методик определения отдельных энантиомеров.

Классическим методом обнаружения и определения оптических изомеров является поляриметрия. Удобна фарадеевская поляриметрия, когда «анализатор» в поляриметре вращается не механически, а электрическим полем.

Главным методом разделения смесей и определения энантиомеров является хроматография, особенно жидкостная. Разделение в этом случае основано на использовании энантиоспецифичнфх неподвижных фаз.

В СССР сложились крупные фармацевтические центры, где анализ лекарственных средств занимал значительное место. Одним из таких центров был Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе (Москва). В конце XX века на базе этого института был создан специализированный центр по исследованию лекарств. Серьезные исследования в области фармацевтического анализа с применением спектрофотометрии выполнялись на Украине и на Северном Кавказе, в Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Анализ биоматериалов с помощью ЯМР

Метод ЯМР позволяет обнаруживать и одновременно количественно определять в биологических жидкостях тысячи компонентов, в том числе метаболиты и биомаркеры, и тем самым проводить достаточно полную диагностику организма, обнаруживать на ранних стадиях различные патологии, в том числе генетически обусловленные заболевания, формировать группы риска пациентов, предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям, отслеживать реакции организма на воздействие патогенов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике.

Основным преимуществом ЯМР является минимальная пробоподготовка. Кроме того, метод позволяет многократно использовать одну и ту же пробу.

Основной недостаток – по чувствительности этот метод уступает хромато-масс-спектрометрии и методам оптической спектрометрии. Но он устраняется с помощью наполнения спектра – суммирование результатов увеличивает соотношение сигнал\шум пропорционально корню квадратному из числа измерений.

Помимо ЯМР 1Н все шире используется ЯМР 13С, а также ЯМР 31Р. Но, из-за небольшой концентрации этих изотопов в организме, применение этих методов ограничено.

При количественном анализе спектра возникают определенные трудности вследствие перекрывания резонансных сигналов различных соединений. Но обычно один и тот же компонент дает сигнал в различных областях, поэтому почти всегда удается найти такую область, в которой один из сигналов достаточно хорошо отделен и пригоден для интегрирования.

Особая сложность количественного анализа биологических жидкостей и тканей, которые могут содержать сотни компонентов в очень большом интервале концентраций, в том, что обычно заранее не известно, до какой глубины необходимо проводить анализ и каким минимальным уровнем содержания компонентов следует ограничиться.

При исследовании тканей методом ЯМР их используют как в нативном, так и в экстрагированном состоянии. Но отбор биожидкостей проще осуществить, поэтому они используются чаще.

При анализе спектров любых биоматериалов возникает ряд общих проблем, решение которых требует специальных методов.

1. Подавление сигнала воды

Вода – это основа любой биожидкости. Ее сигналы всегда интенсивнее сигналов растворенных веществ. Для подавления сигнала воды можно использовать лиофилизацию, а затем растворить осадок в D₂O. Но во время лиофилизации теряются летучие и нестабильные компоненты. Вследствие этого анализ теряет точность.

Чаще для подавления сигнала воды используют специальные импульсные последовательности. Одна из них – метод селективного предварительного насыщения. – на пробу воздействуют радиочастотными импульсами большой длительности, селективно настроенными на частоту сигнала воды. Разработаны и более сложные последовательности.

2. Пробоподготовка

К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D₂O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3-²Н₄]-пропионат натрия.

На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений.

Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.

Для большинства измерений используют частоту ЯМР 500-700 МГц.

3. Методы обработки и интерпретации спектров

Спектр ЯМР любой биологической жидкости – это суперпозиция спектров огромного числа соединений, среди которых лишь несколько десятков представляют реальный интерес, так как только их присутствие или изменение и концентрации несет информацию, важную с точки зрения медицинской диагностики.

Полный анализ занимает много времени, не целесообразен, так как не выполняет основную задачу – быстро обнаружить аномалию и определить ее природу.

Для анализа спектров используется подход, основанный на сверке информации. Сначала отбирают группу «здоровых» людей (от нескольких десятков до нескольких сотен человек) и измеряют спектры взятых у них биологических жидкостей в строго стандартных условиях. Затем каждый спектр преобразуют в гистограмму. При этом количество данных значительно сокращается без существенной потери информации. Затем интегральные интенсивности сводят из гистограммы в таблицу по спектрам для всех измеренных образцов. Полученную матрицу данных обрабатывают с помощью стандартных методов статистического анализа. При анализе биологических жидкостей пациента достаточно определить, вписывается ли значение интенсивностей в средние показатели для здоровых людей.

Идентефикация каждого компонента может оказаться достаточно важной, особенно в случае, если его можно использовать в качестве биомаркера патологии.

В особых случаях может потребоваться предварительное разделение компонентов образца. Для этого чаще всего используют высокоэффективную жидкостную хроматографию или твердофазную экстракцию.

Для ЯМР анализа в основном используют плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость. Ниже приведена таблица, в которой перечислены патологии, которые можно определить при анализе той или иной жидкости.