94765 (Вірусний гипатит С), страница 5

Принцип метода: сироваткові β-глобуліни та ліпопротеїни осаджувалися при рН 7,55 тимоловим реактивом. В залежності від кількості та взаємного відношення окремих білкових фракцій при реакції виникає помутніння, інтенсивність якого вимірювали турбідіметрично.

Реактиви:

Концентрований розчин тимола17 мл

Буфер ТРІС 11 ммоль/л; малонова кислота 3,36 ммоль/л; тимол 6,66 ммоль/л.

Калібровочний розчин 111 мл

Сірна кислота 2,5 моль/л

Калібровочний розчин 25 мл

Барій хлористий 48 ммоль/л

Склад реакційної суміши:

Буфер ТРІС, рН 7,55 (25оС)0,160 ммоль/л

Тимол0,098 ммоль/л

Співвідношення сироватка/ реакційна суміш 1:61

Приготування розчинів:

№1У колбу на 1000 мл налити 900 мл дистильованої води і при постійному перемішуванні магнітною мішалкою поступово додавали 15 мл реактива 1. розчин доповнюют дистильованою водою до мітки і перемішували ще 10 хвилин.

№2У мірну колбу вмістом 250 мл піпеткою поміщували 10 мл реактива 2. доливали охолодженою до +8оС водою до мітки і перемішували.

№3У мірну колбу вмістом 50 мл піпеткою поміщували 1,5 мл реактива 3 і доливали до мітки реактивом 2, охолодженим до 10оС. Перемішували.

Проведення аналізу:

Довжина хвилі (620-660 нм), кювета 1 см, температура +15+25оС.

У двох пробірках змішували розчин 1 у співвідношенні 60+1 з сироваткою чи фізрозчином. У наступній пробірці змішували фізрозчин у співвідношенні 60+1 із сироваткою (контрольній розчин 2) – наприклад 3 мл фізрозчину і 0,05 мл сироватки. Перемішували і залишали на 30 хв. Потім знов перемішували і вимірювали оптичну щільність проби А проти контрольного розчину 1

Калібрували проти контрольного розчину 2.

Калібровки:

№ Проби Розчин 2Розчин 3Одиниці помутнінняS-H

4,51,55

3,03,010

1,54,515

-6,020

Визначення амінотрансферази АЛТ у сироватці крові

Таблиця 1

Методика визначення АЛТ

Принцип методу

Аланін-амінотрансфераза (L-аланін 2-оксоглутарат амінотрансфераза, каталізує реакцію між L-аланіном і 2-оксоглутаратом. У результаті якої вони перетворювалися а L-глутамат і сіль піровіноградної кислоти. Визначення засноване на вимірі оптичної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой і піровіноградної кислот у лужному середовищі. Гідразон піровіноградної кислоти має більш високу оптичну щільність.

Реактиви

1 Еталонний розчин(3 мл)

натрій піровінограднокислий 2 ммоль/л

2,4-дінітрофенілгідразин(100 мл)

розчин 1 ммоль/л у HCl 1 моль/л

Натрій гідроокис (1 флакон)

Субстрат АЛА(2 х 50 мл)

фосфатний буфер 0.1. моль/л,

DL-альфа-аланін 02 моль/л,

2-оксоглутарат 2 ммоль/л

Склад інкубаційної суміші

Фосфатний буфер рн 7.4 (25 С) 83,0ммоль/л

01-альфа-аланін 166.0ммоль/л

2-оксоглутарат 1,7ммоль/л

Співвідношення сироватка крові/інкубаційна суміш 1/6

Визначення амінотрансферази ACT у сіроватці крові

Таблиця 2

Методика визначення АСТ

Принцип методу

Аспартат-амінотрансферази (L-acпартат. 2-оксоглутарат амінотрансфераза каталізує реакцію між L-аспартатом і 2-оксоглутаратом у результаті якої вони перетворювалися а L-глутамат і оксалацетат. Визначення засноване на вимірі оптичної щільності гідразонів 2-оксоглутаровой і піровіноградної кислоти в лужному середовищу. Гідразон піровіноградної кислоти, що виникає при мимовільному декарбоксилюванні оксалацетата, має більш високу оптичну щільність.

Реактиви

1Еталонний розчин(3 мл)

натрій піровінограднокислий 2 ммоль/л

2,4-динитрофенилгидразин(100 мл)

розчин 1 ммоль/л в АЛЕ 1 моль/л

3Натрій гідроокис(1 флакон)

4Субстрат АСТ(2 х 50 мл)

фосфатний буфер 0,1 моль/л,

L-аспартат 0,1 моль/л, 2-оксоглутарат 2 ммоль/л

Склад інкубаційної суміші

Фосфатний буфер рн 7.4 (25 С)83.0 ммоль/л

L-аспартат83.0 ммоль/л

2-оксоглутарат1,7 ммоль/л

Співвідношення сироватка крові/інкубаційна суміш1/6

Готування робочого розчину Розчин гідроокису натрію

У мірній колбі місткістю 1000 мол розчиняли у дистильованій воді уміст флакона з Реактивом с. Стійкість: розчин стійкий

Проведення аналізу

Довжина хвилі(500-530) нм

Кювету1 см

Температура інкубації(37+- 0.1) С

Реактив 4 перед аналізом нагрівали до (37 ± 0.1) С

3. Результати та обговорення

Нами проводилося вивчення ефективності введення в комплексне лікування гепатиту С імуномодулюючих препаратів. Індуктори ІФН, такі як аміксин та циклоферонстимулюють вироблення власних інтерферонів, які не володіють антигенністю, їх рівень не досягає рівня, здатного проявляти ушкоджуючи дію на організм, тому вони мають менше побічних ефектів. Критерієм підбору імуномодулюючих препаратів служить чутливість і ступінь зв'язування з імунними клітинами.

Проводилося вивчення імунних показників: Т - клітинного імунітету, гуморального імунітету, фагоцитарної активності нейтрофілів, цитотоксичної активності НK і печінкових проб (АЛТ, АСТ, тимолової проби і білірубіна) у 35 хворих на гепатит С (табл. 3, 4, 5, 6).

Таблиця 3

Показники клітинного імунітету у хворих на ХГС, %

Спочатку ми отримали дані до лікування, які становили: лейкоцити 4,2*106 кл/л, з них кількість лімфоцитів складала 21,4% (Т-лімфоцити 61,2%, з них Тх – 54,5%, Тс – 6,7%, Тк – 34,6%; В-лімфоцити 15,63%), фагоцитарна активність – 63%.

Отримані дані вказують на те, що при застосуванні аміксину кількість лейкоцитів становила 5,47*106 кл/л, з них кількість лімфоцитів складала 28,2% (Т-лімфоцити 63,8%, з них Тх – 52,3%, Тс – 11,2%, Тк – 47,8%; В-лімфоцити 12,67%), фагоцитарна активність – 51%. Ці показники кращі, ніж при використанні циклоферону: лейкоцити 5,07*106 кл/л, з них кількість лімфоцитів складала 29% (Т-лімфоцити 58,9%, з них Тх – 49,6%, Тс – 12,6%, Тк – 41,5%; В-лімфоцити 9,38%), фагоцитарна активність – 50,15%.

Дані вказують на те, що прийманні імуномоделюючої терапії наближає показники клітинного імунітету до норми, яка становить: лейкоцити 4-8*106 кл/л, з них кількість лімфоцитів складала 19-37% (Т-лімфоцити 55-70%, з них Тх – 40-60%, Тс – 10-20%, Тк – 30-50%; В-лімфоцити 6-15%), фагоцитарна активність – 40-95%.

Таблиця 4

Цитотоксична активність у хворих на ХГС, %

Також ми визначали показники цитотоксичної активності НК-клітин.

До початку лікування цитотоксична активність НК-клітин становила 22,91%. При застосуванні аміксину, цитотоксична активність НК-клітин становила 42,66%. При лікуванні циклофероном цитотоксична активність НК-клітин становила 38,54%. Отримані дані вказують на те, що застосування аміксина, як імуномоделюючого препарата більш наближає цей показник до норми, яка становить 50-95%.

Таблиця 5

Вміст імуноглобулінів у хворих на ХГС, г/л

В наших дослідах ми також визначали показники гуморального імунітету.

До початку лікування показники гуморального імунітету в хворих на гепатит С становили: IgA 2,86 г/л, IgG 16,01 г/л, IgM 1,03 г/л.

При застосуванні аміксину, як імуномоделюючого препарату, показники гуморального імунітету становили: IgA 2,2 г/л, IgG 14,45 г/л, IgM 1,03 г/л.

При застосуванні циклоферону показники гуморального імунітету становили: IgA 2,6 г/л, IgG 14,58 г/л, IgM 0,96 г/л.

Нормальний вміст цих імуноглобулінів у крові становить: IgA 1,2-2 г/л, IgG 9-18 г/л, IgM 0,9-1,2 г/л.

Таблиця 6

Біохімічні показники у хворих на ХГС

Одним з показників, який ми визначали були печінкові проби – проба на білірубін, АЛТ (аланін-амінотрансфераза), АСТ (аспартат-амінотрансфераза) і тимолова проба.