94765 (Вірусний гипатит С), страница 4

М- розеткоутворення (В-лімфоцити)

Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів миші.

Д-фагоцитоз нейтрофілів

Тест Д-фагоцитоза нейтрофілів ставили також, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,06 мл 0,1 % суспензії кліток пекараських дріжджів, вбитих нагріванням.

Е-розеткоутворення після інкубації кліток з теофіліном

(теофілін-резистентні Е- розеткоутворюючі лімфоцити - субпопуляція, збагачена клітками, що володіють хелперною активністю)

У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії кліток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчину теофіліну в середовищі 199. Інкубували при 37 °С протягом 1 години. Далі доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана і ставили реакцію Е- розеткоутворення.

Фіксація і приготування мазків

Після інкубації осаду при + 4 +10°С у лунки обережно, так щоб не зашкодити осад, додавали 0,02 мл фіксатора, приготовленого на основі глутарового альдегіду. Витримували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після цього надосадкову рідину видаляли одночасно з усіх лунок планшета швидким інтенсивним струшуванням. Потім у кожну лунку негайно додавали по 0,05 мл дистильованої води. Осад ресуспендировали у процесі готування мазків. Мазки готували на ацетатцелюлозній плівці у виді краплі, що займає квадрат розміром 9X9 мм. На поверхні прямокутної плівки розміром 90X130 мм міститься 96 мазків.

Можна використовувати флюорографічну плівку шириною 7 см, і мазки займали квадрати 8x8.

Приготування препаратів

Висушені мазки фіксували у метанолі протягом 10 хвилин (чи абсолютному етанолі протягом 20 хвилин). Потім поміщали у розчин метилового зеленого - піроніна. Через 30 хв. мазки виймали, змивали водою, промокали фільтрувальним папіром і сушать у розправленому стані між аркушами фільтрувального папера під вантажем. На висушену плівку наносять тонким шаром розчин канадського бальзаму в ксилолі і накривали ацетатцелюлозною плівкою такого ж розміру, яку щільно притискали. Отримана плівка з 96 препаратами готова до мікроскопії. При відсутності метилового зеленого - піроніна мазки можна фарбувати азуреозином при РН 5-6 протягом 10 хв.

Підрахунок кількості розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток

У препаратах перераховується число розеткоутворюючих лімфоцитів на 50 лімфоцитів і кількість фагоцитуючих нейтрофілів на 50 нейтрофілів із застосуванням об'єктива Х40, при правильному настроюванні світла в мікроскопі по Келлеру. Можна додатково прораховувати в цих препаратах кількість розеткоутворюючих нейтрофілів. За розеткоутворюючу клітку вважали таку клітку, до якої прикріпилося 3 і більша кількість еритроцитів. За фагоцитуючу вважати клітку-нейтрофіл, що захопив 1 чи більшу кількість дріжджових кліток. Обчислювали % розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток.

Визначення абсолютного вмісту розеткоутворюючих кліток у 1 мкл крові

Е-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * Е - РУЛ / 100%

М-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * М - РУЛ / 100%

де, Е-РУЛ - Е- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкл, %;

М-РУЛ - М- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкс, %;

Лі - вміст лімфоцитів у крові тис/мкл.

Визначення кількості теофілін-чутливих Е-РУЛ

ЕТФ-Ч-РУЛ = Е РУЛ - ЕТФ-Р-РУЛ

де, Е-РУЛ - кількість розеткоутворюючих лімфоцитів (спонтанних), %;

ЕТФ-Р-РУЛ - кількість теофілін-резистентних Е-РУЛ;

ЕТФ-Ч-РУЛ - кількість теофілін-чутливих Е-РУЛ, %.

Постановка комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу

Лейкоцити, отримані в процесі забору крові, осаджували центрифугуванням планшетів. До отриманого осаду лейкоцитів доливали середовище 199, після чого суспензію кліток вносять у лунки чотирьох планшетів за допомогою крапельниць. Після цього в планшети вносять відповідні реактиви, і після постановки реакції готували мазки. Усі реактиви вносять у лунки планшетів за допомогою крапельниць. Мазки залишали до повного висихання. Висушені мазки фіксували у метанолі.

Визначення цитотоксичної активності НК-клітин

Отримували клітини мішеней.

Відмивали у среді і розводили до концентрації 106, 5*105, 105 кл/мл для співвідношення клітина-ефектор – клітина-мішень = 1:10, 1:50, 1:100 відповідно.

Постановка реакції:

Активність НК (цитотоксичність) вимірюють мікроскопічним методом. У пластикові камери з плоским дном, вносять 0,1 мл досліджуємих клітин, по 0,1 мл клітин мишей і культивують при 37оС у вологій камері з 5% СО2 протягом 4-16 годин. В контрольну лунку вносили клітини-мішені і використовували живільне середовище.

Оцінка реакції:

Після культивування підраховували кількість непошкоджених клітин у камері Горєва.

Індекс цитотоксичності визначали по формулі:

ІЦ=100%*а-в/а

Де а – кількість еритроцитів у середовищі без ефекторів,

в – кількість еритроцитів у середовищі з ефекторами

Приготування 10-кратного розчину Хенкса

На 1 л розчину беруть NaCl 80,0 г

КС1 4,0 г

MgS04*7H20 2,0 г

CaCI*6H2O 2,75 г

КН2Р04 0, 6 г

Na2HPO4*2H20 1, 53 г

Глюкоза 10, 0 г.

Розливали у невеликі щільно закриті ємності і зберігали у замороженому стані.

Приготування суспензії еритроцитів барана та мишей

Одержували від барана, перед постановкою реакції еритроцити відмивали у фізрозчині, осаджуючи щораз центрифугуванням при 400 g протягом 10 хв. доти, поки надосадкова рідина не стане безбарвною (звичайно 2 - 3 рази). Для готування суспензії 0,01 мл відмитого залишку еритроцитів змішували з 10 мл середовища 199. Суспензію зберігали при температурі + 4 +10°С не більш трьох годин, перед використанням збовтували.

Кров миші безпородної беруть у пробірку з гепарином, Відмивали і готували так само, як і суспензію еритроцитів барана. Збереження таке ж, як суспензії барана.

Суспензія клітин пекарських дріжджів

Ліофілізовані чи свіжі пекарські дріжджі розводять у фізрозчині (співвідношення 1:5 ) і витримували у киплячій водяній лазні протягом 60 хвилин. Зберігали при температурі О- 4°С до 12 місяців. Перед постановкою реакції дріжджі відмивали розчином Хенкса в тім же режимі, що й еритроцити доти, поки рН надосадкової рідини не буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберігати свій колір). Суспензію кліток дріжджів готували і використовували так само, як суспензію еритроцитів.

2.2 Визначення показників гуморального імунітету

Визначення вмісту імуноглобулінів

Імуноглобуліни класів А, М, G - визначали у плазмі крові методом радіальної імунодифузії в гелі в модифікації методу Манчіні.

Одержання плазми

Планшет-штатив, що містить пластмасові трубочки зі зразками крові, центрифугували при 200° 10 хвилин. Верхню частину трубочки, що містить плазму, зрізували і переносять в інший аналогічний штатив у тім же порядку. Отриману плазму можна тривало зберігати в замороженому стані. Перед постановкою реакції плазму разморажували і переносять у лунки планшета, де розводять фізіологічним розчином у 3 рази (співвідношення плазма - фізрозчин 1:2).

Готування пластин, покритих шаром агару

На кришку 96-лункового планшета, що лежить на нагрівальній підставці (температура 50 °С) у строго горизонтальному положенні, наливали 16 мл розчину агару, що містить моноспецифічну сироватку до імуноглобулінів визначеного класу. Після охолодження на кришці виходить рівний шар гелю. У цьому шарі пробійником вирізували лунки діаметром 2 мм відповідно до розміру лунок стандартного 96-ямкового планшета. Таким чином, на пластині одержували 96 лунок.

Розчин агару, що містить моноспецифічну сироватку, готували таким чином: у першу чергу готували розчин, що містить 1,2 % агару, 2 % поліетиленгліколя (м. в. 6000) і 0,01 % мертіолата, інше - фізіологічний розчин. Нагрівали його до 50 °С при перемішуванні, після чого доливали антісироватку, щоб кінцева концентрація її в розчині відповідала зазначеної на ампулі.

Постановка реакції

У лунки першого ряду пластини, покритої шаром гелю, вносять стандартну сироватку нерозведену й у розведеннях 1:2, 1:4, 1:8 у такій кількості, щоб вона заповнила лунку до рівня агару (орієнтовно 3-4 мкл). Лунки інших рядів заповнювали зразками випробуваної плазми в розведенні 1:2. Далі пластини інкубували при 37 °С у вологій камері для визначення рівня ІgG протягом 4-6 годин, ІgA - протягом 12-24 годин, ІgM - 24- 28 годин. Інкубацію припиняли тоді, коли розміри кілець преципітації стандартних сироваток будуть достатні для упевненого виміру діаметрів. Для створення вологої камери зручно використовувати герметично закритий поліетиленовий пакет, на дно якого кладуть відпрацьований 96-луночний планшет, лунки якого наповнені водою.

Облік результатів

По закінченні інкубації на пластинах заміряли діаметри кілець, преципітації за допомогою окуляра-мікрометра в лупі МБС-9 з підсвітом через увігнуте дзеркало, у центрі якого знаходиться чорне коло, чим створюється ефект "темного поля", що різко збільшує контрастність краю преципітату в агарі.

Побудова калібровочної кривої і визначення змісту імуноглобулінів

Вміст імуноглобулінів у випробуваній плазмі визначали каліброваною кривою, яку будували на напівлогарифмічному папері таким чином: по осі абсцис відкладали діаметри кілець стандартної сироватки. По осі ординат - відома кількість імуноглобулінів, що містяться у відповідному образі стандартної сироватки, помножене на 3. Отримані крапки з'єднували. Таким способом будували калібровані криві окремо для кожного класу імуноглобулінів. Якщо по кожному класу тестується одночасно велика кількість зразків плазми (реально до 960) на одночасно приготовлених пластинах агару, то за умови стандартного часу, що витримується чітко, інкубації всіх пластин для даного класу імуноглобулінів калібрована крива залишається незмінної для усіх видів пластин.

Для визначення рівня імуноглобулінів у випробуваній плазмі на осі абсцис, відкладається діаметр кільця преципітації даної плазми, відновлювали перпендикуляр до пересікання з калібровочною кривою, крапку перетинання проектували на осі ординат і відраховували вміст імуноглобулінів відповідного класу.

Визначення вмісту імуноглобулінів

Пластини, покриті шаром агару з моноспецифічною антисироваткою, готували для аналізу всіх 960 зразків плазми і зберігали у холодильнику при + 8°С в герметично закритому поліетиленовому пакеті зі зволоженням. У день доцільно ставити 480 зразків плазми. Прорахунок результатів проводять з використанням бінокулярної лупи Результати перераховували на каліброваній.

Виділення плазми для тестування імуноглобулінів

Планшети-штативи, у яких знаходяться трубочки з кров'ю, центрифугували 10 хвилин при 400 g. Після цього частину трубочки, що містить плазму, відрізали і переносять в інший аналогічний планшет-штатив, що упаковується і зберігається в морозильній камері до визначення вмісту імуноглобулінів.

2.3 Постановка біохімічних тестів

Визначення кількості білірубіна у сироватці крові за методом Йендрашика-Клеггорна-Грофа

Метод використовується для визначення загального і прямого білірубіна в сироватці крові

Принцип методу: діазотована сульфанілова кислота взаємодіє з білірубіном сироватки крові з утворенням комплекса рожево-фіолетового кольору, інтенсивність фарбування якого пропорційна концентрації білірубіна та вимірюється фотометрично. В присутності акселераторів (кофеїновий реактив) визначається загальний білірубін (вільний та зв’язаний), а при їх відсутності – тільки прямий (зв’язаний) білірубін.

Склад набору:

Реагент № 1 Кофеїновий реактив

Кофеїн 52 ммоль/л

Натрій оцтовокислий 184 ммоль/л

Натрій бензойнокислий 104 ммоль/л

Реагент № 2 Сульфанілова кислота

Сульфанілова кислота 29 ммоль/л

Соляна кислота 170 ммоль/л

Реагент № 3 Азотна кислота (4 мл) 72 ммоль

Діазореагент. Перед роботою змішати 10 частин реагента 2 з 0,3 частинами реагента №. 3.

Хід роботи: Внести в пробірки сироватку і реагенти за схемою:

Сироватка0,250,250,25

0,9% розчин NaCl0,252,00,5

кофеїновий розчин1,75-1,75

Диазореагент0,250,25-

Загальний об’єм2,52,52,5

Вміст пробірок ретельно перемішати і залишити при кімнатній температурі для розвитку фарбування. Через 5-10 хв після додавання діазореагента виміряти екстінкцію дослідної проби на прямий білірубін, а через 20 хв – на загальній білірубін. Фотометру вати проти контрольної проби при довжині хвилі 500-560 нм (зелений світлофільтр) в кюветі з довжиною оптичного шляху 5 мм.

Розрахування загального і прямого білірубіна проводять по калібровочному графіку. Непрямий білірубін розраховували по різниці між вмістом загального і прямого білірубіна.

Визначення тимолової проби 300 у сироватці крові