94765 (Вірусний гипатит С), страница 2

Патоморфологічно гепатит С характеризується загальними проявами запалення і некрозу. Разом з тим, на відміну від гепатиту В чи А, а також гепатитів невірусної етіології, для гепатиту С, характерні такі гістологічні ознаки як: наявність у портальних трактах щільних лімфоцитарних агрегатів і фолікулів; интраваскулярні синусоїдальні інфільтрати чи лімфоцитів гиперплазірованних Купфферовскіх клітин при відсутності вираженого некрозу гепатоцитов у безпосереднім оточенні; змінений епітелій жовчних проток; жирова дистрофія. Разом з тим, необхідно враховувати, що спектр ушкодження печіночних клітин при гепатиті С може бути надзвичайно широкий [Кузин, 1999].

У більшості хворих хронічним гепатитом С в плин тривалого періоду часу захворювання має безсимптомний перебіг. У 55-60% випадках реєструються печіночні прояви захворювання. До них відносять: незначне збільшення печінки, підвищення активності сироваткових трансаміназ (у 2-3 рази), що змінюються періодами їхньої нормалізації. У період клінічно виражених симптомів захворювання хворий відзначає стомлюваність, млявість, нездужання, зниження працездатності, поганий сон, почуття ваги в правому підребер'ї. У 40-45% випадків реєструють внепечіночну прояву захворювання. Вважають доведеним, що змішана кріоглобулінемия асоційовано з хронічним гепатитом С. Вона реєструється в 42-96% випадків, а в 10-42% має клінічні прояви: слабість, артралгія пурпуру, синдром Рейно, артеріальна гіпертонія, поразка бруньок. До складу кріопреципітата можуть входити РНК ВГС, антитіла до білок кодованих структурною і неструктурною частиною геному ВГС. У якості інших внепечіночних проявів хронічної ВГС-инфекции розглядають: ендокринні (гіпертиреоз, гипотиреоз, тиреоидит Хашимото); гематологічні (ідеопатична тромбоцитопенія, неходжкінская В-лимфома, апластична анемія та ін.); поразка слинних залоз і око (лімфоцитарний сіалоаденит, виразки роговиці, увеіт); шкірні (пізня шкірна Порфирія, червоний плоский лишай, вузлувата еритема та ін.); нейромишечні і суглобні (міопатичний синдром, синдром Гійена-Барре й ін.); ниркові (гломерулонефрит); автоімунні (вузликовий періартерііт). У більшості випадків внепечінкові прояви реєструються в пацієнтів, схильних до аутоімунних реакцій. В даний час також прийнято вважати інфікування вірусом гепатиту С причиною розвитку гепатоклітиної карциноми [Львов, 1997].

Рідким ускладненням гострого гепатиту С є фульмінантний гепатит при ретроспективних дослідженнях знайшли, що в хворих фульмінантним гепатитом у вік вище 50 років є незалежним прогностичним фактором [Hoofnagle, 1995].

Вірусний Гепатит С часто приводить до хронічного захворювання печінки, і принаймні в 50% хворих розвивається хронічний гепатит. У тих, у кого виникає хронічний гепатит, у 20 - 60% (дані залежать від тривалості спостереження) розвивається цироз печінки [Покровский, 1993].

У хворих хронічним гепатитом С похилого віку титр РНК HCV значно вище такого в молодих пацієнтів. Вірусом гепатиту С часто заражаються в старшому віці, тому в багатьох літніх людей спостерігається активна реплікація вірусу, при тім що цироз печінки ще не встигає розвитися. Для порівняння: вірусом гепатиту В часто заражаються в дитинстві і юності, тому в людей похилого віку не спостерігається активної реплікації вірусу, а цироз до цього часу вже розвивається. Знижена здатність імунної системи літніх справитися з вірусом гепатиту С пояснює більш високу в порівнянні з молодими хворими віремію. Іншим можливим поясненням може служити той факт, що люди похилого віку, як правило, уражаються ВГС типу 1Б, а в заражених вірусом такого типу спостерігається підвищений, у порівнянні з іншими типами вірусу, рівень РНК ВГС у сироватці. Ще одне можливе пояснення полягає в тім, що в обстежуваних хворих вірусним гепатитом С похилого віку виявляється більш важке в порівнянні з молодими захворювання печінки. А титр РНК ВГС збільшується з вагою хвороби печінки [Кузин С.Н., 1999].

1.5 Лабораторна діагностика

При постановці діагнозу "гепатит С" необхідно враховувати наступні найбільш важливі фактори:

показники активності печінкових ферментів;

наявність чи відсутність маркерів інфікування вірусом гепатиту С (ВГС) і іншими гепатотропними вірусами;

дані епідеміологічного анамнезу;

результати клінічного обстежання пацієнта.

Тільки комплексний облік даних факторів дозволяє з високим ступенем надійності діагностувати це захворювання (Laverdant, 1989).

Це дає можливість:

виявити осіб з наявністю ВГС для зниження рівня посттрансфузіонного гепатиту С;

постановка діагнозу і розмежування гострого і хронічного гепатиту С;

прогноз захворювання;

призначення, оцінка і прогноз ефективності проведеної терапії;

вивчення широти поширення ВГС у популяції і різних групах населення.

Основою лабораторної діагностики гепатиту С є знання про ВГС, його реплікації, інформація про динамік появи і зникнення маркерів інфікування, а також сучасні імунохімічні і молекулярно-біологічні методи детекції антигенів, антитіл і нуклеїнових кислот. (Yuasa, 1991)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИ-ВГС. У 1989 році група дослідників фірми "Chіron Corporatіon" під керівництвом Q-L.Choo здійснила клонування РНК ВГС і одержала імунореактивні олігопептиди, що вступають у реакцію з антитілами, що циркулюють у крові хворих хронічним гепатитом "ні А, ні В". Ці олігопептиди стали основою діагностичних препаратів для виявлення антитіл до ВГС (Лакина, 2000)

КОНФОРМАЦІЙНІ ТЕСТИ. Для розмежування ложнопозитивних зразків і зразків, дійсно утримуючі антитіла до ВГС, розроблені додаткові (Supplemental) тести. Найбільше часто в цих тестах використовується принцип імуноблота, коли на нітроцеллюлозной мембрані адсорбуються у виді окремих смуг антигени, кодовані різними зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаємодіють з адсорбованими антигенами за допомогою мічених ферментом антитіл проти Іg людини з наступної їх детекціею за допомогою субстратного комплексу (Prince, 1996).

ВИЗНАЧЕННЯ Іg АНТИ- ВГС. В даний час створені і промислово випускаються діагностичні набори для виявлення Іg анти-ВГС На етапі конструювання діагностичних наборів були створені набори для ИФА, основою яких були пептиди, кодовані різними регіонами РНК ВГС . Вибір був зупинений на пептиді, кодованому Core регіоном РНК ВГС і виявленні антитіл до нього класу Іg (Исаева, 2001)

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИГЕНІВ ВГС. Можливість визначення антигенів ВГС привертала увагу дослідників відразу ж після відкриття вірусу. Принципова можливість їхнього тестування була продемонстрована К. Krawczynskі зі співавторами, що імуногістохімічно знайшли в печіночній тканині антигени ВГС, довівши специфічність імунофлюоресцентного випромінювання. Застосування поли- і моноклональних антитіл до різних антигенів ВГС установило наявність ВГС core Ag, антигенів, кодованих NS3 і NS4 зонами РНК ВГС, у ядрі і цитоплазмі гепатоцитів, у 60-90% хворих хронічним ВГС.Однак подальші дослідження продемонстрували, що антигени ВГС удається знайти менш чим у 5% печіночних клітин (Букринская, 1996).

Установлені:

можливість визначення Core Ag ВГС у сироватці та плазмі крові;

специфічність виявлення Core Ag ВГС;

наявність осіб з циркулюючим антигеном у крові серонегативних по анти-ВГС;

часте (90,3%) виявлення Core Ag ВГС у сироватках крові з наявністю анти-ВГС і РНК ВГС;

пряма кореляція між концентрацією РНК ВГС і виявленням Core Ag ВГС;

Визначено, що Core Ag ВГС удається виявляти в 83% випадків (n=24) наступного дня після першого виявлення РНК ВГС і задовго (у середньому 26 днів) до появи анти-ВГС.

МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної діагностики гепатиту С можна охарактеризувати як етап початку широкого застосування молекулярно - біологічних методів виявлення РНК ВГС. Переважна більшість методів виявлення нуклеїнових кислот було апробовано для виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання діагностичних препаратів і їхньому застосуванню для детекції вірусних ДНК чи РНК присвячене значна кількість літературних оглядів, опублікованих як у вітчизняних, так і закордонних виданнях. Усі ці методи можна розділити на двох груп, в основі яких лежить застосування принципів гібридизації без ампліфікації обраної ділянки нуклеїнової кислоти та з їх ампліфікацією, що дозволяє значно підвищити здатність методу.

МЕТОД ГІБРИДИЗАЦІЇ заснований на з'єднанні мічених гібрідізаціонних зондів (генноінженерні чи синтетичні молекулярні структури, що містять у собі нуклеотидні послідовності, комплементарні обраним ділянкам РНК). Облік результатів здійснюють по інтенсивності сигналу, що надходить від мітки в складі комплексу, що утворився.

При гепатиті С цей метод виявлення РНК ВГС насамперед знайшов застосування для її ідентифікації безпосередньо в гепатоцитах, у тестах що позначаються - іn sіtu hіbіdіzatіon. Можливість безпосередньої детекції РНК ВГС у тканині дозволила знайти її в мононуклеарних клітках крові, клітках слинних залоз і інших тканин організму хворого гепатитом С (Моминалиев, 2000).

МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, ЯКИЙ ЗАСТОСОВУВАЛИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ РНК ВГС, дозволяє продемонструвати наявність негативних (реплікативних) ланцюгів РНК ВГС, що свідчить про активну реплікацію вірусу.

Метод полімеразної ланцюгової реакції - у даний час найбільш широко застосовуваний методичний прийом, що лежить в основі практично всіх молекулярно-біологічних методів детекції РНК ВГС. Причому, визначення РНК ВГС можливе як у якісному, так і кількісному варіанті, що особливо важливо для призначення, моніторингу й оцінки ефективності застосовуваної терапії.

Як основні варіанти методу можна виділити:

полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР);

лігазну ланцюгову реакцію;

NASBA;

ТМА (Реакція транскрипційно-опосередкованої ампліфікації, Transcrіptіon-medіated amplіfіcatіon). У його основі лежить багатоцикловий процес, що нагадує природну реплікацію нуклеїнової кислоти, причому кожен цикл складається з послідовних етапів.

З досліджуваного матеріалу (сироватка, плазма крові, печінковий біоптат) виділяється РНК ВГС. З огляду на те, що нуклеїнова кислота ВГС представлена РНК, а для ампліфікації необхідна молекула кДНК, за допомогою ферменту - зворотної транскриптази, відбувається утворення одноланцюгових молекул кДНК ВГС. На наступному етапі до визначеної ділянки кожного з ланцюгів кДНК ВГС приєднуються т. з. праймери - короткі олігонуклеотиди, комплементарні відомим нуклеотидним послідовностям. Порівняння первинної структури 5'UTR області геному різних ізолятів ВГС виявило їхню незначну мінливість (між генотипами, гомологія нуклеотидів - 92-98%, а у середині генотипу 98-99%).

Далі, за допомогою ферменту ДНК-залежної ДНК полімерази відбувається синтез нових ділянок ДНК. В даний час як джерело цього ферменту найчастіше використовують бактерії Thermophіlus termus (Tth-полімераза) чи Thermophіlus aquatіcus (Taq-полімераза). Володіючи термостабільністю в присутності іонів марганцю і магнію, цей фермент може бути одночасно використаний для синтезу комплементарних одноланцюгових молекул кДНК ВГС і ампліфікації обраних ділянок кДНК. На завершальному етапі одного циклу реакції, за допомогою ДНК полімерази відбувається синтез нових ланцюгів комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення циклів реакції призводить до накопичення фрагментів кДНК ВГС, що можливо зареєструвати за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступною візуальною детекцією чи із застосуванням гібридизації з олігонуклеотидними зондами, що збільшує чутливість і специфічність застосовуваних діагностичних препаратів. Застосування праймерів, мічених ферментами, дозволяє проводити облік результатів ПЛР за допомогою імуноферментного аналізу.

ЛІГАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ виявлення РНК BГ.(LCR).

Метод заснований на здатності ферменту "ДНК- залежної ДНК-лігази" зшивати (лігувати) розриви фосфодіефірного зв'язку в ДНК у присутності АТФ і іонів Mg2+. Так само як і при проведенні "класичної" ПЛР для виявлення РНК ВГС, перший етап LCR - зворотна транскрипція з одержанням кДНК ВГС. Далі ДНК-лігаза здійснює зв'язування двох пар праймерів (комплементарних 5' некодованій зоні РНК ВГС), що надалі ампліфікуються. Детекція продуктів ампліфікації LCR здійснюється за допомогою обліку реакції антитіло-антиген-антитіло. Кожний із двох праймерів мітиться різним гаптеном. Перший з них захоплюється антитілами, адсорбованими на мікрочастинках. Після процедури промивання за допомогою другої пари антитіл, мічених флуоресцентною міткою, відбувається їхня виборча взаємодія з гаптеном в ампліфікаційному продукті з наступним проведенням субстратної реакції й обліком на флюориметрі.

Чутливість цього методу складає близько 200 копій РНК ВГС у мл, що дозволяє його використовувати для рішення різних клініко-діагностичних задач.

NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON - NASBA - метод детекції РНК ВГС заснований на одночасній дії трьох ферментів: зворотної транскриптази вірусу мієлобластоми птахів, РНК-ази Н и РНК-полимерази Т7. На відміну від RT PCR на першому етапі не проводиться зворотна транскрипція РНК ВГС. За допомогою використаних ферментів вдається одержати більш 109 копій ділянки кДНК ВГС протягом 90 хвилин. Можливість проведення реакції при невеликих температурах (+41 С) значно спрощує роботу і дозволяє відмовитися від устаткування, що забезпечує циклічні зміни високих температур. Облік результатів реакції здійснюється за допомогою електрохемілюмінісценції. Незважаючи на те, що по своїй чутливості NASBA близька до RT PCR, метод широко не використовується для виявлення РНК ВГС. В даний час проводиться розробка варіанту методу, що сполучить принципи проведення NASBA і "Real-tіme RT PCR".

КІЛЬКІСНЕ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Для оцінки концентрації РНК ВГС застосовують кількісний варіант ПЛР. Спочатку концентрацію РНК ВГС намагалися охарактеризувати порядковими величинами, наприклад "+","++" і т. д., що візуально відбивають інтенсивність смуг, отриманих при електрофорезі продуктів ампліфікації, чи ж методом кінцевих розведень, по наявності позитивного результату в кінцевій крапці титрування. Труднощі стандартизації всіх етапів ПЛР не дозволяють об'єктивно оцінити концентрацію РНК ВГС, що приводить до істотних помилок трактування отриманих результатів [Масалова, 2000].

В даний час результати дослідження виражають у кількісних одиницях: кількість копій РНК ВГС, що містяться в 1 мл, в абсолютному чи логарифмічному вираженні (log 10). Виходячи з того, що концентрація виявленої РНК ВГС відбиває кількість вірусних часток, даний показник позначають як "вірусний еквівалент (eq)", з додаванням приставки k (кілограм, тисяча) чи М (мільйон). Ще одним способом вираження кількості вірусних часток є їхні вагові еквіваленти. Комітет експертів ВООЗ по біологічній стандартизації виготовив "міжнародний стандартний зразок", що містить РНК ВГС (ліофільно висушена сироватка крові, що містить РНК ВГС 1-го генотипу), концентрація якої виражена в міжнародних одиницях (ІU/m).