90024 (Аминокислоты и РНК), страница 2

Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы: прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (и в ряде случаев хлоропласты).

Оба типа клеток содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки животных) примерно в два раза больше рибосом прокариот (бактерии). Обычно рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации s, выражаемой в единицах Сведберга S.

Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Число рибосом в микробной клетке примерно равно 104, а эукариот — около 105.

Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие только из РНК и белка, причем 80S рибосомы эукариот содержат примерно равное их количество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 2:1. РНК рибосом принято называть рибосомным и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц; это можно при помощи электронной микроскопии или путем обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации ионов Mg2+. При этих условиях рибосомы диссоциируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает размер второй; так, у 70S рибосом величины S для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом, соответственно 60S и 40S. Субчастицы рибосом клеток эукариот устроены более сложно: более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица содержит 28S, 5,8S и 5S рРНК, а малая содержит 18S рРНК (К настоящему времени полностью расшифрована первичная структура всех рРНК в 70S и 80S рибосомах и аминокислотная последовательность всех 55 белков 70S рибосом и частично белков 80S рибосом.).

Для выяснения тонких молекулярных механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы сведения о структуре и функциях рибосом. В последнее время получены данные, свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 30S и 40S рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а третичная структура входящих в их состав 16S и 18S рРНК. Более того, по данным акад. А.С. Спирина, для сохранения пространственной морфологической модели всей 30S субчастицы оказалось достаточным наличие только двух белков, содержащихся в определенных топографических участках молекулы 16S рРНК.

Относительно происхождения рибосом известно, что рРНК происходит из общего предшественника всех клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре; рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где ряд рибосом вместе с мРНК образуют полисомы или полирибосомы.

Аминоацил-тРНК-синтетазы.

Экспериментально доказано существование в любых клетках живого организма специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из E. coli.

Молекулярная масса почти всех синтетаз равна 100 000 Да, за исключением фенилаланин-тРНК-синтетазы (180 000 Да). Все они оказались чувствительными к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg2+. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК; это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе "узнавание" аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеются по крайней мере три центра связывания: для аминокислоты, тРНК и АТФ; ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg2+. Наибольшим сродством эти ферменты, как было указано, обладают по отношению к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока не ясен. В то же время эти ферменты отличаются низкой молярной активностью (число оборотов не превышает нескольких сот каталитических актов в минуту).

Транспортные РНК

В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации 14С-аминокислоты с растворимой с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся белковом осадке метка не открывается. Было сделано заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую молекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся в безбелковом фильтрате. Показано, что РНК, к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую молекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее сначала назвали растворимой, а потом адапторной или транспортной РНК (тРНК). На долю тРНК приходится примерно 10 — 15 % общего количества клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая РНК (для ряда аминокислот открыто более одной, в частности, для серина — 5 разных тРНК, для лизина и глицина — по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой). Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24 000 до 29 000 Да. Они содержат от 75 до 85 нуклеотидов. Аминокислоты присоединяются к свободной 3'-OH-группе концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ, путем образования эфирной связи. Интересно, сто все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой.

Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности, а следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную форму.

Определение структуры тРНК позволило выявить ряд отличительных участков; так, на 3'-гидроксильном конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН- группу концевого аденилового нуклеотида, хотя получены доказательства возможности присоединения аминокислоты через 2'-ОН- группу. Тимин-псевдоуридин-цитидиловая (Т(Ц) петля, по-видимому, связывает аминоацил-тРНК с поверхностью рибосомы. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьируется у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Дигидроуридиловая петля, с другой стороны, оказалась необходимой как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом — аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется также антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, куда присоединяется аминокислота. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они являются антипараллельными в своей комплементарности.

Тщательный анализ нуклеотидных последовательностей разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид — ГМФ со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей аминокислотой. Но поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислоты не существует соответствия и сродства, эту функцию узнавания должна выполнять белковая молекула, которая узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты.

Природа генетического кода

Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, переводится еще в ядре в нуклеотидную последовательность мРНК. Однако вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был выяснен. Первые указания на существования прямой функциональной зависимости между структурой гена и его продуктом — белком можно найти у Ч. Яновского, который в серии изящных опытов с применением методов генетического картирования и сективирования показал, что порядок изменений в структуре мутантного гена триптофанситазы у E. coli в точности соответствует порядку соответствующих изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента.

Ранее было известно, что молекулы мРНК не обладают сродством к аминокислотам, поэтому для перевода нуклеотидной последовательности мРНК на аминокислотную последовательность белков требуется некий посредник, названный адаптором. Молекула адаптора должна быть в свою очередь наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Обладая подобной адапторной молекулой клетка может включать каждую аминокислоту в подходящее место полипептидной цепи, в строгом соответствии с нуклеотидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, незыблемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот не обладают способностью вступать в контакт с матрицей информационной мРНК.

Было показано, что в нуклеотидной последовательности молекулы мРНК имеются кодовые слова для каждой аминокислоты — генетический код. Проблема , однако, сводится к тому, из чего состоит этот таинственный код? Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК . Вопросы о том, какие нуклеотиды ответственны за включение определенной аминокислоты в белковую молекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, оставался нерешенным до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Но код не может быть и дуплетным, т.е. комбинация из двух нуклеотидов из четырехбуквенного алфавита не может охватывать всех аминокислот, так как подобных комбинаций теоретически возможно только 16 (4^2=16), а в состав белка входят 20 аминокислот. Для всех аминокислот белковой молекулы было бы достаточно взять триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (4^3=64).

Из приведенных выше данных М. Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т.е. РНК, гипотетическисодержащая остатки только одного уридилового нуклеотида, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты — фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из 3 уридиловых нуклеотидов — УУУ. Вскоре было показано, что синтетическая матричная полицитидиловая кислота (поли - Ц) кодирует образование полипролина, а матричная полиадениловая кислота (поли-А) — полилизина. Соответствующие триплеты — ЦЦЦ и ААА — действительно оказались триплетами (названными кодонами) для кодирования пролина лизина.

М.Ниренберг, С. Очоа и Х. Корана, пользуясь искусственно синтезированными мРНК, представили доакзательства не только состава, но и последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот белковой молекулы.

Генетический коод для аминокислот является вырожденным. Это означает, что подавляющее число аминокислот кодируетяс несколькими кодонами, за исключением метионина и триптофана, по существувсе остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона. Вырожденность кода оказывается неодинаковой для разных аминокислот. Так, если для серина, аргинина и лейцина имеется по 6 кодовых слов, то ряд других аминокислот, в частности глутаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по два кодона, а триптофан — только 1. Следует отметить, что вырожденность чаще всего касается только третьего нуклеотида, в то время как для многих аминокислот первые два нуклеотида являются общими. Вполне допустимо поэтому предположение, что последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, в то время как третий нуклеотид менее существен. В последнее время появились доказательства гипотезы два из трех, означающей, что код белкового синтеза , возможно, является кввази- или псевдодуплетным. Имеются доказательства, что вырожденность генетического кода имеет несомненный биологический смысл, обеспечивая организму ряд преимуществ. В частности, она способствует "совершенствованию" генома, так как в процессе мутации могут наступать различные аминокислотные замены, наиболее ценные из которых отбираются в процессе эволюции.

Другой отличительной особенностью генетического кода является его непрерывность, отсутствие знаков препинания, то есть сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, одноанправленным и непрерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ. Это свойство генетического кода обеспечивает синтез в высшей степени упорядоченной последовательности молекулы белков. Во всех других случаях последовательность нуклеотидов в кодонах будет нарушаться и приводить к синтезу "бессмысленной" полипептидной цепи с измененной структурой. Следует указать на еще одну особенность кода — его универсальность для всех живых организмов: от Е. соli до человека.

Среди 64 мыслимых кодонов смысл имеет 61, то есть кодирует определенную аминокислоту. В то же время три кодона, а именно УАГ, УАА, УГА являются бессмысленными, нонсенс-кодонами, так как они не кодируют ни одной из 20 аминокислот. Однако эти кодоны не лишены смысла, поскольку выполняют важную функцию в синетзе белка в рибосомах (функцию окончания, терминации синтеза).